【摘 要】
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新型鸭呼肠孤病毒病是由新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)引起的一种主要以脾坏死为特征病变的新疫病。现阶段我国大部分水禽养殖地区都已出现NDRV的感染,但感染NDRV的成年鸭群初期并无明显症状,且容易造成垂直传播,而目前既没有相应成型的商品化试剂盒可用于检测NDRV的抗体,也没有商品化疫苗和特效药物可对该病进行防控,给NDRV的防控带来了双重的挑战。因此,本研究利用
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新型鸭呼肠孤病毒病是由新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)引起的一种主要以脾坏死为特征病变的新疫病。现阶段我国大部分水禽养殖地区都已出现NDRV的感染,但感染NDRV的成年鸭群初期并无明显症状,且容易造成垂直传播,而目前既没有相应成型的商品化试剂盒可用于检测NDRV的抗体,也没有商品化疫苗和特效药物可对该病进行防控,给NDRV的防控带来了双重的挑战。因此,本研究利用实验室保存的NDRV质控血清,基于重构NDRV σC蛋白建立了可快速检测NDRV抗体的间接ELISA(Indirect ELISA,iELISA)方法,并对河北地区采集的临床样本进行检测,以确定河北省是否已存在NDRV的感染。而后,利用本实验室分离到的NDRV,配合分子佐剂制备具有良好中和活性的卵黄抗体,以期提纯出的高效价IgY,在临床防控中可有效预防和治疗NDRV疾病。首先,为建立灵敏快速检测NDRV抗体的iELISA方法,填补无成型商品化试剂盒的空缺。本研究基于先前报道σC蛋白为不溶性表达的结果,利用大肠杆菌的密码子偏嗜性等规律优化了其基因序列进行原核表达。采用方阵滴定法确定σC蛋白包被浓度和样品稀释度,初步建立检测NDRV抗体的iELISA方法,并以该方法分别对84份阳性和180份阴性质控血清进行检测与分析,构建样品测定的特征曲线,通过Youden指数选择阴阳性判定的临界点。用本研究和实验室先前建立的全病毒iELISA方法同时对质控血清进行检测和比较;同时对临床上50只经RT-PCR检测NDRV后的鸭只,取其血清样本用该方法进行检测比较。结果显示:优化表达方法后可得到高纯度的可溶性σC蛋白。通过方阵滴定法确定的iELISA方法中σC蛋白最佳包被浓度为0.5 μg/孔,最适血清稀释度为1:320。按上述条件建立的iELISA检测质控血清,根据其结果构建的特征曲线线下面积为1.00,最佳阴阳临界值为0.076,其灵敏性和特异性均为100%。与全病毒iELISA检测方法的符合率为100%,但全病毒iELISA方法检测弱阳性样品的OD450值较低,σC蛋白包被板则弥补了这一缺点;对RT-PCR检测过的50份临床样本进行检测,二者符合率为90%,特异性和灵敏性良好。本研究为NDRV抗体检测提供了可靠的iELISA方法。而后,为了预防和应对新型鸭呼肠孤病毒引起的疾病,本研究利用先前分离到的新型鸭呼肠孤病毒,制备并提纯具有良好中和活性的高效价IgY。本研究使用三种灭活疫苗(其中两种分别添加IL-2、CpG分子佐剂)免疫蛋鸡,通过水稀释法提纯IgY。提取的IgY经Western-blot鉴定后,进行细胞层面的中和试验和iELISA试剂盒检测,而后取效价最高的三种IgY进行鸡胚保护试验。结果显示:三免后14 d中和抗体滴度达到峰值,而后趋于平稳(>26),且添加CpG和IL-2分子佐剂的组别提取的IgY比未添加分子佐剂的组别中和滴度提高约3倍;三免后14 d抗体效价达到峰值,而后趋于平稳(P%>70),且添加CpG和IL-2分子佐剂的组别提取的抗σC蛋白IgY效价高于未添加分子佐剂的组别。将抗体注入鸡胚进行攻毒保护试验,显示中和组的保护率最高,预防组略高于治疗组,且CpG组所提取的IgY预防效果(83%)和治疗效果(75%)最佳。本研究提取的高效价IgY能应用到临床防控中,可有效预防及治疗新型鸭呼肠孤病毒病。
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