【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）主要引起妊娠母猪的繁殖障碍及仔猪的呼吸道疾病,是威胁我国乃至全球养猪业健康发展的重要病原之一,对PRRSV及其抗体的快速、准确的鉴定有助于本病的防控。本研究运用免疫层析技术,建立了一种灵敏度高、特异性强,且便捷、快速,适于现场检测的PRRSV抗体检测方法。根据
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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）主要引起妊娠母猪的繁殖障碍及仔猪的呼吸道疾病,是威胁我国乃至全球养猪业健康发展的重要病原之一,对PRRSV及其抗体的快速、准确的鉴定有助于本病的防控。本研究运用免疫层析技术,建立了一种灵敏度高、特异性强,且便捷、快速,适于现场检测的PRRSV抗体检测方法。根据在PRRSV的整个基因组中是最为保守且在各个毒株之间的同源性能够达到80%以上的PRRSVM基因序列设计引物,从PRRSV阳性材料中扩增出完整的M基因并对其进行了序列分析,结果显示,本研究扩增出的两条M序列属于美洲型的谱系5。与美洲型的各个亚型代表毒株的核苷酸同源性在89.3%～99.8%,氨基酸的同源性均在92%以上。将本研究扩增出的M全基因（CH-HB-BD1）第85位～173位氨基酸,命名为PRRSV-dM。使用截短后的PRRSV dM基因连接表达载体pET32a,转化到E.coli BL21感受肽细胞后,进行表达条件的优化,对其获得的重组蛋白纯化、复性及鉴定,结果表明,在25℃,0.2mmol/L的IPTG浓度下,诱导4 h以包涵体的形式表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定显示,蛋白大小31 kDa和预期大小一致且特异性较好。将重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,使用间接ELISA和饱和硫酸铵沉淀法及Western blot对制备的鼠抗PRRSV dM多抗效价的测量及纯化、鉴定,结果显示,多抗效价为1:102400,纯化后浓度达到11.56 mg/mL且特异性较好,进一步为免疫层析方法的建立提供了材料基础。为确定最适的胶体金pH值和重组蛋白的使用量,通过稳定性试验和OD530nm值的测量相结合,结果表示,在pH 7.0,重组蛋白pET32a-dM浓度为20.38μg/mL时,可使制备的金标抗原耐受10%的NaCl溶液。进一步以方阵试验确定金标抗原的稀释度以及T线和C线包被的最佳浓度,方阵结果表明,当金标抗原以1:5稀释,T线重组蛋白pET32a-dM包被浓度为1 mg/mL,C线鼠抗PRRSV dM多抗包被浓度为2 mg/mL时,可使试纸条显色最佳。组装好的试纸条点样验证结果:（1）有效性:经PRRSV抗体阳性和阴性血清点样后,在15 min内,阳性的T线和C线均出现条带,阴性只有C线一条条带;（2）特异性:只有PRRSV抗体阳性的血清出现两条条带,其他样品只有C线显色,无交叉反应;（3）灵敏性:可检测到1:1600稀释的阳性血清;（4）重复性和稳定性:批间批内不存在差异且稳定性较好。使用本研究制备的PRRSV抗体检测试纸条与IDEXX试剂盒同时对78份临床样品检测,两者结果比对发现,阳性符合率达到91.84%,统计学软件SPSS 26分析后,kappa系数为0.893,两种检测方法具有较高的一致性。综上所述,本研究建立的PRRSV抗体免疫层析检测方法,操作简便,检测快速,为临床PRRSV抗体的检测提供了一种新的选择。
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