【摘 要】
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目的:表达小鼠IRG1（immune responsive gene 1,IRG1）蛋白,制备兔抗小鼠IRG1多克隆抗体;获得稳定高表达IRG1巨噬细胞株,对高表达细胞株免疫功能进行鉴定。方法:从脂多糖（LPS）刺激后的Raw264.7巨噬细胞中提取总RNA,然后逆转录成c DNA,根据Genebank上小鼠IRG1的ORF区设计PCR引物。经Eco RⅠ和XhoⅠ酶切后连入p GEX-4T-1原
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目的:表达小鼠IRG1（immune responsive gene 1,IRG1）蛋白,制备兔抗小鼠IRG1多克隆抗体;获得稳定高表达IRG1巨噬细胞株,对高表达细胞株免疫功能进行鉴定。方法:从脂多糖（LPS）刺激后的Raw264.7巨噬细胞中提取总RNA,然后逆转录成c DNA,根据Genebank上小鼠IRG1的ORF区设计PCR引物。经Eco RⅠ和XhoⅠ酶切后连入p GEX-4T-1原核表达载体,转化到BL21（DE3）大肠杆菌中,经IPTG诱导表达融合蛋白,并对IPTG诱导条件进行优化,用谷胱甘肽S转移酶（GST）层析柱进行亲和纯化。以纯化的小鼠IRG1蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗小鼠IRG1多克隆抗体。以ELISA检测所获抗血清的抗体效价,用Western blot检测所获抗血清的特异性,心脏采血收集血液。把IRG1连入pc DNA3.1真核表达载体,稳定转染到Raw264.7巨噬细胞,通过RT-PCR、western blot筛选获得高表达IRG1细胞株,提取总RNA,逆转录成c DNA,通过Q-PCR检测目的基因表达情况。结果:经酶切、PCR及核酸序列分析,重组原核、真核质粒均包含有正确的小鼠IRG1的ORF。SDS-PAGE电泳分析显示p GEX-4T-1/IRG1表达一相对分子量约为74KD的融合蛋白,与预期相符。IPTG诱导优化条件为0.4mmol/ml、37℃、7h最优。免疫家兔后经耳缘静脉采血,用ELISA检测抗体效价,抗体效价达到预期标准时心脏采血,收集抗血清并用Western blot检测抗体的特异性。经RT-PCR、western blot鉴定,获得稳定高表达IRG1细胞株,通过对比该细胞株与空载体转染细胞株发现部分基因在IRG1高表达细胞株中出现上调表达如:MCP-1、IL-1、IL-12等;另有一部分基因呈现下调表达,如:CD11c、CD16、CD32等。结论:本研究成功构建了p GEX-4T-1/IRG1、pc DNA3.1/IRG1重组质粒,在大肠杆菌BL21（DE3）内完成了GST-IRG1融合蛋白的可溶性表达,并利用GST-IRG1融合蛋白免疫新西兰兔获得效价大于1:16000的兔抗鼠多克隆抗体,为免疫印记、免疫组化等实验提供了可靠的工具。经G418筛选获得稳定高表达IRG1细胞株,经Q-PCR基因水平检测,发现IRG1促进巨噬细胞MCP-1的表达,下调巨噬细胞的抗原提呈功能以及吞噬功能。
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