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慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是呼吸系统常见病、多发病。据统计COPD居当前死亡原因的第四位,我国15岁以上人群COPD患病率高达3%,全国约有2500万COPD患者[1]。迄今国内外对本病的治疗尚缺乏有效的方法。膈肌是最重要的呼吸肌,在呼吸运动中所起的作用占全部呼吸肌的60%-80%[2]。膈肌功能减退是COPD的显著病理特征之一,COPD患者常易发生膈肌疲劳,进而产生呼吸衰竭。对膈肌疲劳防治的方法主要有改善膈肌收缩性的药物治疗、机械通气使膈肌休息、呼吸肌锻炼、膈肌起搏等[3-4]。目前研究发现通过改善膈肌功能可以延缓COPD的发生发展[5],现临床上常用生理频率慢性电刺激(40Hz)对COPD患者进行膈肌康复治疗,取得了一定的疗效。膈肌起搏的应用缘于膈肌对电刺激的适应性变化与骨骼肌相似的实验基础。不同频率的电刺激可使骨骼肌结构、代谢及功能发生不同的变化。膈肌属于骨骼肌,慢性电刺激(Chronic electric stimulation, CES)可使膈肌产生与骨骼肌类似的适应性改变。近年研究发现[6、7],COPD患者在轻、中度时其膈肌I、II型纤维萎缩,重度者则表现为I型纤维比例增加,膈肌收缩功能受损,蛋白降解增加,对Ca2+敏感性降低,横桥周期性的运动减慢。慢性生理频率电刺激可以使萎缩的膈肌运动单位重新募集,各类型纤维功能增强,以保持肌纤维比例的相对正常。因此,生理频率电刺激使COPD膈肌纤维类型的转化不是临床所需求的最佳肌纤维重构,40Hz慢性电刺激不是COPD膈肌康复治疗的最佳频率。慢性低频电刺激(CLES)可使骨骼肌快收缩纤维和肌球蛋白重链(Myosin heavy chain, MHC)向慢收缩肌纤维和MHC转化,同时Ca2+调节系统和代谢酶活性[8-10]也发生相应的适应性变化,结果是肌肉抗疲劳能力增加,疲劳恢复时间缩短;生理频率慢性电刺激可以改善萎缩的膈肌功能,各类型纤维功能增强,低频复合生理频率慢性电刺激(10+40Hz)综合了两种刺激模式的优势,达到既增强呼吸肌收缩强度,又增加呼吸肌耐力的目的,从而改善COPD患者的呼吸肌功能,提高生活质量。本课题拟通过观察不同频率慢性电刺激后肺气肿兔模型膈肌结构、能量代谢、膈肌力学和兴奋-收缩偶联的适应性变化特征和规律,以期阐明低频复合生理频率慢性电刺激(10+40Hz)防治膈肌疲劳的机理,为低频复合生理频率体外膈肌起搏防治COPD患者膈肌疲劳提供理论依据。本课题主要包括以下内容:(一)兔肺气肿模型的建立及慢性电刺激动物模型的制备1.采用木瓜蛋白酶雾化吸入法建立兔肺气肿模型。2.采用自行研制的变频便携式体外膈肌起搏器进行慢性电刺激建立慢性电刺激动物模型。(二)不同频率慢性电刺激后膈肌MHC亚型、代谢酶活性的实验观察1.观察不同频率慢性电刺激后肺气肿兔动脉血气的变化。2.采用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定不同频率慢性电刺激后肺气肿兔膈肌MHC亚型的改变。3.采用南京建成生物工程研究所提供的琥珀酸脱氢酶(SDH)测试盒、乳酸脱氢酶(LDH)测试盒测定不同频率电刺激后肺气肿兔膈肌代谢酶活性的改变。(三)不同频率慢性电刺激后肺气肿兔膈肌力学特征、钙释放单位与肌浆网(SR)Ca2+摄取、释放功能变化的实验观察1.采用Rm6240多道生理信号采集处理系统测定不同频率慢性电刺激后肺气肿兔膈肌力学特征的改变。2.采用南京建成生物工程研究所提供的Ca2+-ATP酶测试盒测定不同频率电刺激后肺气肿兔膈肌Ca2+-ATP酶活性的改变。3.用Fura-2荧光法观察不同频率慢性电刺激后肺气肿兔膈肌SR Ca2+摄取—释放动力学的变化。4.用RT-PCR技术观察不同频率慢性电刺激对肺气肿兔膈肌Ryanodine受体(RyR1-3)mRNA表达的影响。主要结果1.兔肺气肿模型肺组织病理检测显示,光镜下可见肺组织稀疏,肺泡间隔变窄,其内毛细血管受压,部分肺泡间隔断裂消失,由若干肺泡融合形成肺大泡,呈典型肺气肿病理表现。2. 40Hz、10Hz、10+40Hz慢性电刺激后肺气肿兔PaO2、SaO2增加,PaCO2降低(P<0.05);10+40Hz组较40Hz、10Hz组PaO2、SaO2增加更加显著(P<0.05)。3.在MHC亚型测定实验中,40Hz、10Hz、10+40Hz慢性电刺激后肺气肿兔膈肌MHC的相对含量都有所增加(P<0.01);10Hz组MHC-I型比例明显增加,10+40Hz组MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱa型比例增加(P<0.01)。4.在膈肌代谢酶活性测定实验中,40Hz、10Hz、10+40Hz慢性电刺激后肺气肿兔膈肌SDH活性增高(P<0.05),LDH活性没有明显变化;10+40Hz组较40Hz、10Hz组SDH活性增高更加显著(P<0.05)。5.在观察膈肌力学特征的实验中,40Hz、10+40Hz慢性电刺激后,肺气肿兔膈肌颤搐收缩张力(Pt)、强直颤搐收缩张力(Po)明显增加,峰值张力时间(TPT)、1/2松弛时间(1/2Rt)明显缩短,疲劳指数(FI)和疲劳恢复指数(FRI)明显下降(P<0.01);10Hz组Pt、Po降低(P<0.05),TPT、1/2Rt延长,FI、FRI下降(P<0.01)。10+40Hz组较40Hz组FRI、FRI下降更加显著(P<0.01)。6.在观察膈肌SRCa2+释放摄取动力学变化的实验中,40Hz、10+40Hz慢性电刺激后,肺气肿兔膈肌SRCa2+-ATP酶活性增高,SR Ca2+释放、摄取速度明显增加(P<0.01);RyR1mRNA、RyR3mRNA表达显著上调(P<0.01);10Hz组Ca2+-ATP酶活性降低,SR Ca2+释放、摄取速度明显减慢(P<0.01)。RyR1mRNA表达减少(P<0.01)。10Hz电刺激组可见RyR2mRNA轻度表达,其余实验组未见RyR2mRNA表达。结论1.低频复合生理频率慢性电刺激可使肺气肿兔膈肌肌纤维由IIb型向Ⅰ、Ⅱa型转化,这种膈肌结构上的适应性变化是其功能改变的基础。2.低频复合生理频率慢性电刺激较生理频率慢性电刺激和低频慢性电刺激可更显著地增强肺气肿兔膈肌氧化代谢酶活性,使膈肌有氧氧化能力得到更明显的提高。3.低频复合生理频率慢性电刺激及生理频率慢性电刺激均可增强肺气肿兔膈肌SR Ca2+摄取―释放功能,改善兴奋-收缩偶联,提高膈肌收缩力及耐力,但前者使肺气肿兔膈肌耐疲劳能力增强及呼吸功能改善更加显著。提示低频复合生理频率慢性电刺激可能是体外膈肌起搏对COPD患者膈肌康复治疗更佳的频率模式之一。