研究背景 肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上最具破坏性的恶性肿瘤之一,早期筛查和诊断有助于提高患者的五年生存率。但HCC起病隐匿,早期往往无明显症状,容易漏诊或误诊。目前常用的早期筛查肝癌的方法仍为血清学标志物辅助检查结合影像学方法,但它们早期诊断的检出率不高对于肝癌的早期治疗价值有限。因此,真正意义上的“早发现”亟待更灵敏特异的肿瘤标志物来及早甄别出早期患者,同时仍需要开发一种更加精确、便捷、高效的方法来提升肿瘤的诊疗效能早期诊断、早期治疗和精准个体化治疗是目前癌症医疗方面的目标,液体活检通过检测肿瘤释放到血液中的循环游离DNA、microRNA（miRNA）等核酸分子以及肿瘤血小板（tumor-educated platelets,TEPs）、循环肿瘤细胞、外泌体等结构,能够突破组织病理活检的限制,提高血清学标志物的灵敏度和特异性,同时具有非侵入性检测、均质化肿瘤异质性、可重复性高、耗时较短以及能够实时监测肿瘤的发展变化和治疗效果等优点,在实验室研究和临床实践中发挥着越来越重要的作用。其中,miRNA是一种小、非编码RNA,可以与靶信使RNA（mRNA）特异性碱基互补配对,通过转录后水平负向调控mRNA来调节基因表达和细胞过程,因而可以作为疾病靶向治疗的工具。因此,以miRNA为靶点建立诊疗一体化技术逐渐成为肝癌个体化诊疗最有价值的手段之一。然而,现有的miRNA检测方法如原位杂交、northern blot、数字PCR、荧光定量逆转录PCR、二代测序等技术,通常需要复杂的引物设计、多次温度循环、昂贵的仪器设备以及专业人员的操作,而且无法同时满足高特异度、高灵敏度及原位检测的临床诊疗需求,限制了miRNA在临床上的进一步应用。综上,本研究针对肝癌相关miRNA建立了全新的生物诊疗平台,并对其检测和负反馈调节miRNA能力进行了验证,为液体活检在早期肝癌诊断中的应用提供了新的思路和方法。此外,通过研究肝癌患者中肿瘤教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的表达水平,为肝癌的早期筛查提供了一定的参考价值。研究目的1.探究肝癌患者中肿瘤教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的表达水平及其对肝癌的诊断价值;2.结合DNAzyme的变构调节原理和DNA四面体结构的稳定性,设计开发能够同时实现胞内miRNA原位检测和负反馈调控的新型DNA纳米机器,为疾病的同时诊断和治疗提供一种集成的工具。研究方法1.选取肝癌患者15名及同期的健康人群15名,分为肝癌组和健康对照组。采用低速离心法提取受试者血浆中的血小板,采用实时荧光定量PCR检测富血小板悬液中教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的相对表达量,并采用受试者工作曲线分析它们在肝癌诊断方面的临床价值。2.设计了一个基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器用于细胞内miRNA的同步灵敏检测和负反馈调节。该纳米机器包括一个DNA四面体框架和一个核心的miRNA抑制剂控制的变构DNAzyme。利用DNA四面体框架使DNAzyme和底物在空间上相互接近并且促进DNAzyme的细胞摄取和抗酶降解能力。在DNAzyme的变构调节中,被锁定的四面体DNAzyme（L-tetra-D）和活性四面体DNAzyme（A-Tetra-D）的结构转换受miRNA抑制剂的调节。miRNA抑制剂和靶标的结合可以触发从L-tetra-D到A-Tetra-D的构象变化,后者切割底物并释放荧光用于miRNA的传感。同时,由于miRNA抑制剂与miRNA的互补配对,实现对靶细胞的同步调节。3.通过原子力显微镜和聚丙烯酰氨凝胶电泳对基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器的组装进行表征。采用FAM荧光作为输出信号进行荧光检测,进一步优化其检测miRNA的性能,评估其检测的灵敏度和特异性。4.通过细胞毒性实验和激光共聚焦荧光测量方法评估基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器在细胞内的生物相容性、稳定性和检测能力,并应用RT-PCR、蛋白质印迹技术评估下游基因和蛋白（PTEN/PDCD4）的表达量,采用流式细胞术评估细胞凋亡情况,验证其对miRNAs的调控效果。研究结果1.肝癌患者教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的相对表达量均上调,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。miRNA-122和miRNA-21诊断原发性肝癌的曲线下面积（AUC）分别为0.987和0.916。2.成功设计并合成了基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器,经过原子力显微镜分析其具有四面体的形状。该纳米机器具有良好的灵敏度和特异性,其最低检测限为0.77 p M,线性范围为1 p M-1 n M,回归方程为:Y=8.191×lg（C）+65.31,R~2=0.9562。3.验证了基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器对于细胞没有显著的毒性,并且可以在活细胞内稳定存在至少8小时,能够满足活细胞内miRNA原位检测的需求。该纳米机器可以实现活细胞内miRNAs表达量的半定量检测,同时能够检出表达异常的细胞。4.在基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器的作用下,下游基因和蛋白（PTEN/PDCD4）表达量均实现上调,肿瘤细胞凋亡增加,验证了该纳米机器同时具有检测和细胞内负反馈调控miRNAs的能力。研究结论1.肝癌患者血浆中教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的表达水平明显升高,其相对表达量可以有效区分肝癌患者和健康对照组,肿瘤教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21有望成为诊断肝癌的潜在分子标志物。2.成功建立了基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器,该纳米机器具有良好的特异性、敏感性、生物相容性和稳定性,可通过靶向miRNA调节细胞的基因（mRNA）/蛋白水平,促进肿瘤细胞凋亡。3.基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器的设计为细胞内miRNA的同步检测和调控提供了一个集成的诊疗一体化工具,有望应用于癌症的早期诊断和个性化管理。