一、研究背景及意义胃癌（gastric cancer,GC）是中国的第二大最常见和最高致死率的癌症类型,具有较高发病率和死亡率。近年来随着胃癌的早期诊断、外科治疗、放化疗等诊治方案的不断进步,其死亡率呈缓慢下降趋势,但是晚期胃癌患者的预后仍然很差。临床研究表明,胃癌的局部和远处转移是导致患者预后不良的主要原因,因此探索胃癌进展分子机制显得尤为重要。细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）是细胞生存相关微环境的重要组成成分之一,其参与了细胞各项基本生命活动。近些年来研究表明,细胞外基质与肿瘤的发生发展有着密切的关系。基质细胞蛋白是细胞外基质的重要组成部分,是重要的细胞外调节剂,其在肿瘤细胞的增殖、转移等病理性生物活动中具有重要的调控作用。TINAGL1（Tubular interstitial nephritis antigen like 1,TINAGL1）是一种新型的基质细胞蛋白,其最早发现于肾小管间质性肾炎组织中,并且与肾小管的炎症损伤相关。TINAGL1在多种肿瘤类型中发挥促进肿瘤亦或抑制肿瘤的双重作用。但是,TINAGL1在胃癌中的表达、在胃癌发展中的作用及其临床意义尚不清楚。因此,本研究旨在揭示基质细胞蛋白TINAGL1在胃癌中的表达、作用机制及临床意义。二、研究目的1.明确TINAGL1在胃癌中表达情况及其临床意义2.探究TINAGL1在体外和体内对胃癌细胞增殖和转移的作用3.阐明TINGAL1促进胃癌细胞的增殖与转移的机制三、研究方法1.明确胃癌组织及胃癌细胞系中TINGAL1表达情况及其临床意义使用Kaplan-Meier plotter数据库分析TINAGL1高表达组和TINAGL1低表达组的胃癌患者与疾病预后情况的相关性。通过q RT-PCR、ELISA、Western blot以及免疫组化方法分别检测胃癌组织和正常组织中TINAGL1的m RNA和蛋白表达及分布。Western blot检测TINAGL1在胃癌细胞系中表达情况。2.探究TINAGL1对胃癌细胞增殖与转移的作用利用慢病毒转染获得TINAGL1敲低表达的HGC-27及SGC-7901细胞株,分别用q RT-PCR及Western blot检测转染敲低效果。在体外,使用TINAGL1敲低表达的HGC-27及SGC-7901细胞通过CCK8和Transwell实验分别检测胃癌细胞增殖及迁移情况。在体内,用TINAGL1敲低表达的SGC-7901细胞分别在皮下成瘤模型、腹腔扩散模型和肺远端转移模型中探究TINAGL1对胃癌进展的作用。3.阐明TINAGL1促进胃癌细胞增殖与转移的作用机制使用q RT-PCR测定敲低表达TINAGL1的SGC-7901细胞MMPs表达。GEPIA数据库研究TINAGL1与MMPs之间的关系。基因芯片明确胃癌组织中MMPs家族的表达情况。q RT-PCR检测胃癌组织和相应正常胃组织中MMP2表达差异。Kaplan-Meier plotter数据库中分析MMP2的表达与胃癌患者的生存时间的关系。Western blot检测TINGAL1敲低组荷瘤瘤体中MMP2蛋白表达情况。重组TINAGL1蛋白分别刺激HGC-27和SGC-7901细胞,q RT-PCR检测MMP2表达变化。使用重组TINAGL1刺激SGC-7901细胞,ELISA检测p-IκBα,p-JNK,p-STAT3,p-p38 MAPK,p-NF-κB p65和NF-κB p65的表达水平。Western blot检测敲低表达TINGAL1的HGC-27和SGC-7901细胞中JNK及p-JNK表达量的变化。JNK信号通路抑制剂预处理SCG-7901细胞,再用重组TINAGL1刺激SCG-7901细胞,Western blot检测MMP2的表达量变化。四、研究结果1.TIANGL1在胃癌组织及胃癌细胞系中表达增高并且与胃癌患者预后不良相关。Kaplan-Meier生存曲线提示,TINAGL1高表达组的胃癌患者生存时间显著高于低表达组。胃癌组织中TINAGL1在RNA水平和蛋白水平上的表达较正常组织显著增高。免疫组化提示,TIANGL1在胃癌组织中大量表达,对应正常胃组织表达较低。在不同胃癌细胞系中,TINAGL1有不同程度的表达,其中TINAGL1在HGC-27和HGC-7901细胞中表达相对较高。以上说明TINAGL1在胃癌组织及胃癌细胞系中表达增高并且与胃癌患者的预后不良相关。2.TINAGL1在体外和体内能够促进胃癌细胞增殖与转移。在体外,CCK8实验提示,TINAGL1敲低表达的HGC-27及SGC-7901细胞株,其增殖能力明显下降,在72h最明显;Transwell实验提示,TINAGL1敲低表达的HGC-27及SGC-7901细胞株,其迁移能力降低。在体内,皮下成瘤模型中,相对于对照组,TINAGL1低表达组瘤体体积和重量显著减小和降低;在腹腔转移模型中,TINAGL1低表达组腹腔转移瘤体结节较对照组减少;在肺部远端转移模型中,相对于对照组,TINAGL1低表达组肺部转移瘤体结节显著减少。以上说明TINAGL1能够在体内和体外促进胃癌的生长与转移。3.TINAGL1能够调控多种MMPs的表达。MMPs家族基因在TINAGL1敲低表达的胃癌细胞系的表达测定结果提示,敲低TINAGL1后,MMP2,MMP9,MMP11,MMP14和MMP16的表达显著降低。GEPIA数据库分析结果表明,TINAGL1与MMP2,MMP9,MMP11,MMP14和MMP16具有显著的线性相关关系。以上初步确定TINAGL1参与调控胃癌MMP2,MMP9,MMP11,MMP14,MMP16的表达。4.TINAGL1通过激活JNK信号通路调控MMP2的表达。基因芯片筛选结果提示,MMPs在胃癌组织内上调,其中MMP2表达最高。Kaplan-Meier生存曲线提示,MMP2高表达的胃癌患者预后较差。使用重组TINAGL分别刺激HGC-27和SGC-7901细胞,MMP2表达上调。WB结果提示敲低表达TINGAL1后,MMP2的表达则降低。在体外,用重组TINAGL1分别刺激HGC-27和SGC-7901细胞ELISA检测结果提示,JNK磷酸化水平随着时间而升高。用重组TINAGL1刺激胃癌细胞后JNK磷酸化水平增高同时伴随着MMP2表达上调,sh TINAGL1的胃癌细胞结果相反;用JNK抑制剂预处理后,重组TINAL1刺激胃癌细胞表达MMP2的效应减弱。以上说明TINAGL1主要通过激活JNK信号通路来调节MMP2的表达。五、研究结论1.TINAGL1在胃癌组织中表达增高且与胃癌患者预后不良相关。2.TINAGL1在体外和体内能够促进胃癌细胞的增殖与转移。3.TINAGL1参与调控了胃癌多种MMPs的表达。4.TINAGL1通过激活JNK信号通路调控胃癌细胞MMP2的表达。六、研究意义本次实验发现了胃癌组织中高表达的基质细胞蛋白TINAGL1,其高表达与胃癌患者的预后不良相关;发现了TINAGL1在体外和体内能够促进胃癌细胞增殖和转移;证实了TINAGL1与MMPs的表达相关,具体来说,TINAGL1通过激活JNK信号通路调控了胃癌细胞MMP2的表达。TINAGL1在胃癌中的表达、作用机制及其临床意义的揭示将为胃癌的临床诊疗提供新的理论基础。