TETs和山羊子宫液、血浆外泌体对山羊早期妊娠的影响

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在山羊妊娠过程中,胎盘是影响山羊胚胎发育和生长的重要因素。妊娠早期胎盘发育异常会造成流产、胎儿发育不良、发育迟缓等诸多问题。妊娠早期胎盘发育的调控机制复杂。TET(Ten-Eleven Translocation)蛋白家族在调控胚胎和胎盘发育等过程中具有重要作用,输卵管与子宫内膜细胞的死亡平衡会影响受精卵及早期胚胎的发育。但TETs是否参与早期胚胎发育过程中的输卵管或子宫内膜细胞的生命活动还不清楚。研究表明,外泌体在各种体液中均存在,并且含有多种蛋白质、脂质、核酸等生物成分,可以作为细胞间通讯载体,能够介导细胞与细胞之间、细胞与组织之间生物信息的转运,进而调节靶细胞或靶组织的功能。目前关于山羊体液外泌体的分离、鉴定及对胎盘发育的调控功能等方面还鲜有研究。本研究以山羊为研究对象,首先探究了空配19d(C19)与妊娠19d(P19)山羊输卵管及子宫角中TETs及细胞程序性死亡相关基因、炎症相关基因的表达规律,并分析了TETs与细胞程序性死亡基因之间的相关关系;其次,抽提、鉴定C19组及P19组子宫液外泌体,并研究了山羊子宫液对胎盘滋养层细胞增殖的影响;最后,对非妊娠(NP)及妊娠30d(P30)山羊血浆外泌体进行抽提、鉴定并进行miRNAs测序,筛选出差异表达的miRNAs并进行靶基因预测和功能分析,初步明确山羊血浆外泌体中潜在调控胎盘滋养层细胞的miRNAs。具体研究结果如下所示:1.山羊妊娠早期输卵管及子宫角TETs与细胞程序性死亡关键基因存在相互关联通过对C19组及P19组山羊输卵管及子宫角中TETs及细胞程序性死亡相关基因的表达规律和相关性分析的研究发现,与C19组相比,P19组山羊输卵管中,TET2(P<0.01)、NF-kB(P<0.01)、Caspase1(P<0.01)、GSDMD(P<0.05)显著增高,相关性分析表明,输卵管中TET2与TET3(P<0.01)、NF-kB(P<0.01)、Caspase9(P<0.05)显著正相关;P19组山羊子宫角腺体增多,形态多变,胚胎附植关键基因OPN、BAX/BCL2的表达量显著增加(P<0.05),相关性分析表明,OPN与细胞焦亡相关基因Caspase1(P<0.01)、NLRP3(P<0.05)、GSDMD(P<0.05)显著正相关;而细胞焦亡关键基因GSDMD在输卵管及子宫角中均与Bax(P<0.05)、Caspase1(P<0.01)、NLRP3(P<0.05)呈显著正相关。2.山羊子宫液外泌体对山羊胎盘滋养层细胞增殖的影响通过对子宫液和子宫液外泌体总蛋白检测发现,P19组子宫液和子宫液外泌体总蛋白含量高于C19组。通过子宫液和子宫液外泌体对胎盘滋养层细胞增殖的研究发现,C19组和P19组山羊子宫液均能够显著提高增殖标记基因PCNA的表达(P<0.05),在山羊子宫液外泌体中,两组的外泌体均可以被胎盘滋养层细胞摄取,但只有P19组能够极显著提高增殖标记基因PCNA的表达(P<0.01)。3.妊娠早期山羊血浆外泌体miRNA的鉴定及对胎盘滋养层细胞增殖的影响(1)通过对NP组及P30组山羊血浆外泌体的浓度测定发现,P30组山羊血浆外泌体浓度更高(P<0.05),而且能够抑制胎盘滋养层细胞的增殖;(2)构建山羊NP组及P30组血浆外泌体6个small RNA库,送公司进行外泌体mi RNA测序,筛选出217个差异表达的miRNAs,其中116个miRNAs上调,101个miRNAs下调。在差异表达的miRNAs中,mdo-miR-31-5p、ssa-miR-137-3p、novelmiR1355、novelmiR734、novelmiR736等仅特异性表达于P30组中,暗示在早期妊娠过程中具有一定作用,或许可以作为早期妊娠诊断的标志因子;(3)对NP组及P30组山羊血浆外泌体差异表达miRNAs的靶基因进行预测及功能分析,结果显示其靶基因显著富集到Notch信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路。通过上述试验得到如下研究结论:(1)TETs参与调控妊娠早期输卵管中凋亡及炎症相关基因的表达,细胞焦亡对早期胚胎的附植具有一定的影响,而且细胞凋亡与焦亡的发生对输卵管、子宫及早期胚胎的发育具有协同性。(2)分离鉴定了山羊子宫液、血浆外泌体,初步揭示了山羊子宫液、血浆外泌体对胎盘滋养层细胞增殖的影响。(3)筛选鉴定山羊血浆外泌体差异表达的mi RNAs,并对靶基因进行了预测及功能分析,初步明确了山羊血浆外泌体中潜在调控早期妊娠的miRNAs。
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