【研究背景】骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,主要发生于青少年,常累及长骨干骺端,如股骨远端或肱骨、胫骨的近端。在青少年生长发育时,长骨的干骺端代谢活跃,而骨肉瘤常常发生于此,提示骨肉瘤的发生可能与快速骨生长有关。自本世纪70年代采取术前化疗以来,病人5年生存率得到明显提高。但近30年来,无论尝试新化疗药物或联合化疗,病人生存率没有得到提高。对于诊断时已有肺转移或术后复发的病人,愈后更差。现阶段对骨肉瘤的发生的分子学机制了解甚少,制约了新的靶向治疗的开展。近来研究发现Wnt信号途径在骨的发育中扮演重要角色。Wnt信号途径包括β-catenin依赖途径,即经典型Wnt信号通路和β-catenin非依赖途径,即所谓的非经典Wnt信号途径(包括Wnt／Ca2+和Wnt/JNK途径)。许多研究发现经典型Wnt信号途径是骨骼发生的重要调控因素,而非经典型Wnt通路的作用尚不清楚。因此,本研究主要涉及经典型Wnt信号途径。Wnt信号途径活化是间充质干细胞向骨细胞分化所必须的条件之一。后来,它通过调节骨原细胞的增值和分化来参与调控骨的发生。研究发现在成年小鼠的骨原细胞中,Wnt信号途径是活化的。骨肉瘤的诊断标准是高度异性的肿瘤细胞伴有肿瘤样骨样基质,肿瘤样骨样基质类似正常成骨中的骨基质,提示肿瘤细胞可能来自骨细胞,但失去终末分化的能力。Wnt信号途径活化是正常骨发育的重要因素,但它是否参与骨肉瘤的形成尚不清楚。大量研究证明Wnt信号途径成员的突变导致过度活化的Wnt信号通路促进内胚层上皮细胞来源的肿瘤发生,如肠道肿瘤。但是关于Wnt信号途径在中胚层间充质细胞起源的骨肉瘤发生中的作用尚不清楚。早先研究根据在骨肉瘤标本中检测到Wnt配体或细胞膜／浆β-catenin表达,推测活化的Wnt信号途径促进骨肉瘤的发生。但这种研究方法存在一定缺陷,因为复杂的Wnt信号通路由多个配体、受体、共同受体及细胞抑制因子组成,仅检测Wnt家族一员如Wnt配体不足以证明Wnt信号途径是激活的,而β-catenin进入细胞核是Wnt信号活化重要标志,因此检测细胞核β-catenin的表达是证明Wnt信号途径活化的可信方法。大量研究发现激活Wnt信号通路促进间充质干细胞向骨细胞分化,因而对Wnt信号通路的干预,成为治疗骨质疏松新的药物靶点或骨组织再生工程学的研究热点。以往的研究表明Wnt信号通路的过度激活与某些肿瘤的发生密切相关,因此这些研究最大的担忧是激活Wnt信号途径是否会诱发骨肿瘤。本文通过研究Wnt信号途径在骨肉瘤中发生的作用,对于解除这一担忧具有一定指导意义。本研究系统探讨Wnt信号途径在骨肉瘤发生中的作用,我们通过检测细胞核β-catenin在骨肉瘤、骨肉瘤细胞系和骨母细胞瘤(良性骨肿瘤)中的表达,同时检测调节Wnt信号途径对骨肉瘤细胞增殖和向骨细胞分化的影响。明确Wnt信号途径在骨肉瘤的作用不仅有助于深入认识骨肉瘤发生的机制,而且将为骨肉瘤的治疗提供新的思路和理论依据。【研究目的】1.明确Wnt信号途径在骨肉瘤中状态。2探索激活Wnt信号途径对骨肉瘤细胞增值和分化的影响,为今后临床治疗骨肉瘤提供新思路。【研究方法】1.免疫组化方法检测细胞核β-catenin在52例人骨肉瘤活检组织、15例人骨母细胞瘤(良性骨肿瘤)标本和骨肉瘤细胞系中的表达；2.运用Wnt荧光素酶报告基因检测骨肉瘤细胞MG-63、SJSA-1、HOS和U-2-OS中Wnt信号途径的活性,RT-PCR方法检测Wnt信号抑制剂DKK-1的表达；3.检测GIN (GSK3β抑制剂)和配体Wnt3a是否能激活Wnt信号途径：根据Wnt荧光素酶报告基因的活性、细胞核β-catenin的表达和Wnt信号通路的靶基因Axin2的表达的变化；4.MTS方法检测激活Wnt信号途径对骨肉瘤细胞增值的影响；5.通过检测碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase, ALP)和骨原结节的形成(Alizarin Red染色)探讨激活Wnt信号途径对骨肉瘤细胞向成骨细胞分化的影响。【实验结果】1.Wnt信号途径在骨肉瘤中失活首先运用免疫组织化学方法检测β-catenin在骨肉瘤活检标本中的表达。研究结果发现在骨肉瘤标本中,在90%的标本中细胞核β-catenin染色呈阴性,其余的10%标本中β-catenin弱核阳性,而细胞膜或胞浆β-catenin阳性见于90%(47／52)标本中。在15例骨母细胞瘤中,β-catenin染色呈核强阳性,同时细胞浆／膜也阳性,但其中的破骨细胞β-catenin染色为阴性。在骨肉瘤细胞系中,我们运用Wnt荧光素酶报告基因检测Wnt信号途径的活性。在阳性对照结肠癌细胞SW480,纠正后的Wnt荧光素酶值为10左右,而在所有骨肉瘤细胞中,其值只有0.002～0.01(比SW480低1000～5000倍),这个数值与阴性对照pGL-3强度相似。Wnt荧光素酶报告基因检测结果表明在骨肉瘤系中Wnt信号途径处于失活状态。免疫荧光检测β-catenin结果发现在所有的骨肉瘤细胞系中,细胞核β-catenin染色阴性,这一结果也表明Wnt信号途径是失活的。2.在骨肉瘤细胞中GIN激活Wnt信号途径前面的结果显示在骨肉瘤细胞中Wnt信号途径失活,而Wnt信号途径是正常骨细胞分化所必须的因素之一。因此,下一步检测GIN和Wnt3a是否能够激活Wnt信号途径。GIN通过抑制GSK3β阻止β-catenin的降解进而激活Wnt信号途径。在骨肉瘤细胞系MG-63、SJSA-1、HOS和U-2-OS中,GIN (0.2μM)处理24h后Wnt荧光素酶报告基因活性提高10-200倍(p<0.01)。同时,在DMSO对照组,免疫荧光显示细胞膜β-catenin阳性,而在GIN处理所有的骨肉瘤细胞系后,细胞核β-catenin染色强阳性。与DMSO处理组相比,GIN (0.2μM)处理后的细胞Wnt靶基因Axin2 mRNA表达增加10-60倍(p<0.01)。Wnt3a是常用的Wnt配体,与受体结合后激活Wnt信号途径。在阳性对照细胞C2C12中,50ng/ml;和100ng/mlWnt3a处理后Wnt荧光素酶报告基因活性呈浓度依赖性增加,而在所有骨肉瘤细胞系中,Wnt3a作用后,未发现Wnt荧光素酶报告基因活性增加,同时也未发现Wnt3a作用后促进细胞核表达β-catenin。3.DKK-1在骨肉瘤细胞中表达前面的研究结果发现GIN能够激活Wnt信号途径,而Wnt3a却不能,推测Wnt配体和受体的结合环节受到阻碍。为了进一步探索导致Wnt信号途径失活的原因,我们应用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测Wnt抑制剂DKK-1 mRNA的表达。同Hela细胞相比,我们发现在MG-63、SJSA-1和HOS细胞中,DKK-1 mRNA的表达较高,但在U-2-OS细胞中未检测到DKK-1mRNA的表达。4.激活Wnt信号途径促进骨原细胞分化Wnt信号途径激活是间充质细胞向骨细胞分化必须的,而前面的研究结果发现Wnt信号途径在骨肉瘤中失活,因此下一步检测在骨肉瘤细胞中激活Wnt信号途径是否能促进其向骨原细胞分化。我们在诱导骨肉瘤细胞向骨原细胞分化的几个不同时间段激活Wnt信号途径,即在不同时间段加入GIN,如在分化开始前3天、分化开始前3天至分化开始后前3天、分化开始后的前3天和分化开始后的前7天。ALP活性(第7天)和骨原结节的形成(第21天)是骨原细胞分化早期和晚期的标志。在MG-63和U-2-OS中,未加GIN处理时ALP活性较低,同时没有骨原结节形成,在不同的时间段运用GIN处理激活Wnt信号途径对ALP活性和骨原结节没有影响。在SJSA-1和HOS细胞中,未加GIN处理时ALP活性较高,并有骨原结节形成。同对照组相比,结果发现激活Wnt信号途径组(分化开始后的前3天或前7天的GIN处理组)ALP活性增高(p<0.01)和骨原结节形成增多；而预先激活Wnt信号途径(分化开始前3天GIN处理组)对ALP活性和骨原结节形成没有影响。5.激活Wnt信号途径抑制骨肉瘤细胞增殖接下来,我们检测激活Wnt信号途径对骨肉瘤细胞增值的影响。与DMSO对照组相比,GIN (0.2μM)作用4天后对SJSA-1和HOS细胞增殖几乎没有影响,而在MG-63和U-2-OS,细胞增殖率只有对照组50%(p<0.01)。【结论】本研究首次报道Wnt途径在骨肉瘤中是失活的,这一结论与以往的研究观点不同。前人研究根据细胞膜和／或细胞浆β-catenin的表达得出骨肉瘤中Wnt信号途径激活的结论。本实验结果显示Wnt信号途径关键因子细胞核β-catenin在骨肉瘤标本和骨肉瘤细胞中不表达,而在骨母细胞瘤中细胞核β-catenin强阳性表达,并且在骨肉瘤细胞中激活Wnt信号途径抑制细胞增殖或促进向骨原细胞分化,因此我们推测骨正常发育所必须的Wnt信号途径的丢失是促进骨肉瘤发生因素。本研究对Wnt信号途径失活的机制进行初步探讨。GIN在骨肉瘤细胞中可以激活Wnt信号通路,而Wnt3a不能,同时检测到Wnt通路抑制剂DKK-1的高表达,表明Wnt抑制剂的过表达可能是导致Wnt通路失活的原因之一。大量研究表明,激活的Wnt信号途径在上皮性肿瘤中扮演促进肿瘤发生的角色,而我们的结果支持Wnt信号途径在间叶来源的骨肉瘤的发生中可能起抑癌的作用,我们这一发现提示Wnt信号途径的作用可能是器官或组织依赖性的。