血吸虫病是一种严重危害公共健康、影响社会发展的人兽共患寄生虫病。感染人类的血吸虫主要三种,我国曾是日本血吸虫病严重流行的国家。尽管在过去的六十多年里我国已经采取了一系列血吸虫病综合防治策略并且获得了较好的成效,但是仍然面临许多挑战。根据最新的统计资料,截至2014年中国约有453多个血吸虫病流行县,其中居住人口达2.51亿,感染者多达11万人。吡喹酮是目前唯一用于血吸虫病治疗的有效药物。但是吡喹酮的治疗具有短效性,无法预防血吸虫的再次感染,且在疫区长期大规模的应用有可能提高药物的耐药性。因此,研制安全有效的日本血吸虫病疫苗是综合防治血吸虫病的重要目标之一。一般而言,抗血吸虫感染的免疫保护性机制认识多集中于CD4+T细胞和抗体应答上。首先,CD4+T细胞产生的IFN-γ被认为是关键因素。IFN-γ能够活化肺部的巨噬细胞产生NO,从而介导对血吸虫童虫的杀伤。其次,抗体应答在致弱疫苗诱导的保护力与血吸虫特异性IgG抗体水平呈正相关。但是CD8+T细胞在血吸虫感染中发挥的作用一直是人们争论的焦点。Tat-融合蛋白可以高效地转导到细胞中,被蛋白酶水解后经MHC-I类分子途径递呈给CD8+T淋巴细胞,从而能够优势诱导CD8+T细胞介导的免疫反应。在本研究中,我们构建了由蛋白质转导域HIV-1 TAT和日本血吸虫抗原Sj-TPI组成的重组蛋白Tat-TPI,评估了重组蛋白Tat-TPI的免疫原性及其在小鼠模型中的抗感染保护效果。本实验采用的重组蛋白表达方法有助于蛋白进入细胞内,从而提高CD8+T细胞和CD4+T细胞反应。本研究主要获得以下结果：1.表达、纯化重组蛋白Tat-TPI和TPI构建重组质粒pET-32a (+)-Tat-TPI和pET-32a (+)-TPI。将重组质粒转化至宿主菌BMRosetta (DE3)用于蛋白表达,经IPTG诱导表达和镍NTA琼脂糖凝胶FF纯化,获得纯化的重组蛋白Tat-TPI和TPI。2.重组蛋白被日本血吸虫感染小鼠血清识别纯化的重组蛋白Tat-TPI和TPI均能被日本血吸虫感染小鼠血清识别,说明重组蛋白具有良好的抗原性。3.小鼠胭窝淋巴结的免疫反应为了解重组蛋白Tat-TPI和TPI引起的免疫反应,我们以Tat-TPI、TPI和PBS分别经足垫免疫BALB/c小鼠,观察胭窝淋巴结的T细胞反应。在蛋白注射4天后,Tat-TPI和TPI组较PBS对照组相比均能激发小鼠胭窝淋巴结的Tcl反应(尸<0.01)。更重要的是,Tat-TPI较TPI更能有效地激发CD4+IFN-y+T细胞反应。4.CDS+T细胞能够辅助Thl应答为确定CD8+T细胞是否能辅助Thl应答,我们在体外利用抗小鼠CD8a抗体来封闭脾细胞中的CD8+T细胞。流式结果表明：与TPI相比,Tat-TPI能刺激脾细胞产生更高水平的CD3+CD4+IFN-y+T细胞。当CD8+T细胞封闭后,Tat-TPI组中CD4+IFN-y+T细胞比例出现显著性低于其他组的水平(P<0.05)。5.重组蛋白Tat-TPI和TPI免疫与日本血吸虫感染的免疫保护相关日本血吸虫尾蚴感染6周后,我们计算了小鼠的虫荷量和肝脏的卵荷量。与PBS对照组相比,Tat-TPI免疫组虽然没有达到预期的减虫率(11.9%)和肝脏减卵率(12.4%),但是三次免疫可诱导产生较高水平的Th1、Tcl和IgG免疫应答,且显著减小肝脏中虫卵肉芽肿的面积。综上所述,本次研究成功表达了重组蛋白Tat-TPI,其免疫接种后有助于提高CD8+T细胞免疫应答,并辅助CD4+T细胞产生IFN-γ。虽然我们的免疫策略未达到理想的减虫和减卵效果,但是可以减轻小鼠肝脏病理损伤。