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第一部分 上调结肠高亲和力胆碱转运体CHT1可缓解应激诱导的痛觉高敏
背景：肠易激综合征（irritable bowel syndrome, IBS）是一种常见的功能性胃肠病，痛觉高敏是其重要特征，但机制尚不明确。已知胆碱能系统参与多种疾病的疼痛调控过程，且主要起抑制作用，然而肠道胆碱能系统在IBS痛觉高敏中所起的作用仍不明确。
目的：旨在探讨高亲和力胆碱转运体CHT1（胆碱能信号传导能力的主要决定因素）是否参与应激诱导内脏痛相关的肠道感知的调节过程。
材料和方法：通过慢性避水应激（ water avoidance stress, WAS ）建立Sprague-Dawley（SD）大鼠的IBS内脏痛模型。使用苏木素-伊红染色检测结肠组织病理改变。通过结直肠扩张（colorectal distension, CRD）引起的腹部回缩反射（abdominal withdrawal reflex, AWR）评分和肌电图（electromyogram, EMG）的内脏运动反应（visceromotor response, VMR）幅度评估内脏感知。并通过计数von Frey filaments（VFFs）试验引起的回缩事件的数量评估腹部机械痛觉高敏。采用实时荧光定量PCR（quantitative reverse-transcription polymerse chain reaction, qRT-PCR），western blot和免疫染色检测结肠组织中CHT1 mRNA转录、蛋白质表达及定位。酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定结肠中乙酰胆碱（ acetylcholine, ACh ）的分泌，并评估胆碱摄取增强剂（MKC-231）和核转录因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）抑制剂（ammonium pyrrolidinedithiocarbamate, PTDC）对内脏痛的影响。
结果：研究发现避水应激暴露10d后，结直肠扩张引起的大鼠腹部回缩反射评分和内脏运动反应幅度显著增强，并且VFF诱导的回缩事件数量也有所增加。避水应激暴露后，大鼠结肠中CHT1的蛋白表达及mRNA转录水平上调。且与对照组相比，WAS组大鼠结肠中CHT1阳性的肌内细胞及CHT1阳性的肌间神经丛神经元的密度显著增加。而PDTC处理可部分阻断WAS组大鼠结肠中CHT1表达上调并缓解其疼痛。通过灌胃法给与MKC-231处理以增强CHT1活性可通过上调结肠中CHT1蛋白表达和增强ACh产生缓解WAS大鼠的内脏疼痛。
结论：结肠水平的CHT1可通过调节ACh合成在应激诱导的内脏痛中发挥镇痛作用，且NF-κB信号通路介导了对应激状态下CHT1的调控作用。MKC-231是治疗痛觉高敏性疾病的潜在有效药物。
第二部分 高亲和力胆碱转运体CHT1对应激诱导的痛觉高敏的脊髓调控作用
背景：肠易激综合征是一种常见的功能性胃肠道疾病，而痛觉高敏是其主要特征，但其机制尚不清楚。已知脊髓胆碱能系统参与多种疾病的疼痛调控，但其是否参与肠易激综合征的疼痛调控过程尚不明确。
目的：为了确定胆碱能循环的限速步骤—高亲和力胆碱转运体CHT1介导的胆碱摄取和转运，是否参与应激诱导痛觉高敏的脊髓调控过程。
材料和方法：通过慢性避水应激建立大鼠的内脏痛觉高敏模型。组织学评估结肠病理学改变，并通过检测结直肠扩张诱导的腹部回缩反射和内脏运动反应幅度评估内脏感知。通过计数VFFs试验引起的回缩事件的数目确定腹部机械痛觉敏感性。进行实时荧光定量PCR、western blot和免疫染色以确定脊髓中CHT1的表达。采用ELISA测量脊髓中ACh的分泌，并评估椎管内注射MKC-231（胆碱摄取增强剂）和hemicholinium-3（HC-3, CHT1的特异性抑制剂）对内脏痛的影响。免疫组织化学染色评估脊髓后角小胶质细胞的功能状态，并测试minocycline （小胶质细胞激活特异性抑制剂）对内脏痛的影响。
结果：慢性避水应激暴露10d后，大鼠对结直肠扩张诱导的腹部回缩反射评分和内脏运动反应的幅度明显增强，且对 VFF 测试引起的回缩事件的数量也显著增加。WAS组大鼠脊髓中CHT1的蛋白质表达和mRNA转录水平较对照组上调，且WAS组大鼠脊髓后角CHT1阳性细胞密度高于对照组。椎管内注射HC-3能明显增强WAS组大鼠的疼痛反应。相反，椎管内注射MKC-231可通过增加脊髓ACh的释放以及抑制小胶质细胞活化而缓解避水应激诱导的疼痛反应。
结论：CHT1可通过增加脊髓ACh合成以及抑制脊髓后角小胶质细胞激活，在慢性应激性痛觉高敏的脊髓调控中发挥镇痛作用。MKC-231 是治疗痛觉高敏性疾病的潜在有效药物。
第三部分 高亲和力胆碱转运体CHT1对原代培养海马神经元和小胶质细胞的影响
背景：神经元-小胶质细胞相互作用参与了痛觉高敏的调控过程，而胆碱能系统在该过程中起重要作用。高亲和力胆碱转运体CHT1介导的胆碱摄取及转运是胆碱能循环的限速步骤。然而，CHT1对神经元及小胶质细胞功能的影响尚不明确。
目的：旨在探讨高亲和力胆碱转运体CHT1是否参与神经元及小胶质细胞功能的调控。
材料和方法：取孕16-18d的SD孕鼠及出生1-3d的SD仔鼠分别行海马神经元原代培养和大脑皮层小胶质细胞原代培养，倒置显微镜下观察细胞的生长状态，并行免疫荧光染色鉴定细胞纯度。通过脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）处理建立神经元及小胶质细胞的损伤模型。采用实时荧光定量 PCR、western blot及免疫荧光染色法确定培养物中CHT1的表达。ELISA法测定ACh的分泌，并评估胆碱摄取增强剂（MKC-231）对神经元及小胶质细胞培养物ACh分泌、神经生长因子（ nerve growth factor, NGF ）和原肌球蛋白相关激酶 A （tropomyosin-related kinase A, TrkA）等疼痛相关分子及IL-6等炎症因子的影响。
结果：采用本实验的细胞培养方法可成功培养原代神经元和小胶质细胞，且培养物的纯度和质量满足后续实验的要求。免疫荧光双染显示CHT1可在神经元和小胶质细胞中高表达。LPS处理可使海马神经元中CHT1和生长相关蛋白43 （ growth-associated protein 43, GAP43 ）的表达下降， TrkA 的表达增加，而MKC-231可部分逆转这些改变。此外，MKC-231处理还能进一步逆转LPS诱导的神经元ACh分泌减少。LPS处理可引起小胶质细胞培养物中IL-1β、TNF-α和NGF转录水平上调，同时使IL-4转录下调、p38磷酸化水平增加及ACh释放减少，而MKC-231处理可部分逆转上述改变。
结论：CHT1可通过影响ACh的合成、NGF/TrkA信号通路激活及神经元的生长对 LPS 诱导的神经元损伤和小胶质细胞激活起保护作用。这为神经炎症性疾病的治疗提供了新的靶标。
背景：肠易激综合征（irritable bowel syndrome, IBS）是一种常见的功能性胃肠病，痛觉高敏是其重要特征，但机制尚不明确。已知胆碱能系统参与多种疾病的疼痛调控过程，且主要起抑制作用，然而肠道胆碱能系统在IBS痛觉高敏中所起的作用仍不明确。
目的：旨在探讨高亲和力胆碱转运体CHT1（胆碱能信号传导能力的主要决定因素）是否参与应激诱导内脏痛相关的肠道感知的调节过程。
材料和方法：通过慢性避水应激（ water avoidance stress, WAS ）建立Sprague-Dawley（SD）大鼠的IBS内脏痛模型。使用苏木素-伊红染色检测结肠组织病理改变。通过结直肠扩张（colorectal distension, CRD）引起的腹部回缩反射（abdominal withdrawal reflex, AWR）评分和肌电图（electromyogram, EMG）的内脏运动反应（visceromotor response, VMR）幅度评估内脏感知。并通过计数von Frey filaments（VFFs）试验引起的回缩事件的数量评估腹部机械痛觉高敏。采用实时荧光定量PCR（quantitative reverse-transcription polymerse chain reaction, qRT-PCR），western blot和免疫染色检测结肠组织中CHT1 mRNA转录、蛋白质表达及定位。酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定结肠中乙酰胆碱（ acetylcholine, ACh ）的分泌，并评估胆碱摄取增强剂（MKC-231）和核转录因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）抑制剂（ammonium pyrrolidinedithiocarbamate, PTDC）对内脏痛的影响。
结果：研究发现避水应激暴露10d后，结直肠扩张引起的大鼠腹部回缩反射评分和内脏运动反应幅度显著增强，并且VFF诱导的回缩事件数量也有所增加。避水应激暴露后，大鼠结肠中CHT1的蛋白表达及mRNA转录水平上调。且与对照组相比，WAS组大鼠结肠中CHT1阳性的肌内细胞及CHT1阳性的肌间神经丛神经元的密度显著增加。而PDTC处理可部分阻断WAS组大鼠结肠中CHT1表达上调并缓解其疼痛。通过灌胃法给与MKC-231处理以增强CHT1活性可通过上调结肠中CHT1蛋白表达和增强ACh产生缓解WAS大鼠的内脏疼痛。
结论：结肠水平的CHT1可通过调节ACh合成在应激诱导的内脏痛中发挥镇痛作用，且NF-κB信号通路介导了对应激状态下CHT1的调控作用。MKC-231是治疗痛觉高敏性疾病的潜在有效药物。
第二部分 高亲和力胆碱转运体CHT1对应激诱导的痛觉高敏的脊髓调控作用
背景：肠易激综合征是一种常见的功能性胃肠道疾病，而痛觉高敏是其主要特征，但其机制尚不清楚。已知脊髓胆碱能系统参与多种疾病的疼痛调控，但其是否参与肠易激综合征的疼痛调控过程尚不明确。
目的：为了确定胆碱能循环的限速步骤—高亲和力胆碱转运体CHT1介导的胆碱摄取和转运，是否参与应激诱导痛觉高敏的脊髓调控过程。
材料和方法：通过慢性避水应激建立大鼠的内脏痛觉高敏模型。组织学评估结肠病理学改变，并通过检测结直肠扩张诱导的腹部回缩反射和内脏运动反应幅度评估内脏感知。通过计数VFFs试验引起的回缩事件的数目确定腹部机械痛觉敏感性。进行实时荧光定量PCR、western blot和免疫染色以确定脊髓中CHT1的表达。采用ELISA测量脊髓中ACh的分泌，并评估椎管内注射MKC-231（胆碱摄取增强剂）和hemicholinium-3（HC-3, CHT1的特异性抑制剂）对内脏痛的影响。免疫组织化学染色评估脊髓后角小胶质细胞的功能状态，并测试minocycline （小胶质细胞激活特异性抑制剂）对内脏痛的影响。
结果：慢性避水应激暴露10d后，大鼠对结直肠扩张诱导的腹部回缩反射评分和内脏运动反应的幅度明显增强，且对 VFF 测试引起的回缩事件的数量也显著增加。WAS组大鼠脊髓中CHT1的蛋白质表达和mRNA转录水平较对照组上调，且WAS组大鼠脊髓后角CHT1阳性细胞密度高于对照组。椎管内注射HC-3能明显增强WAS组大鼠的疼痛反应。相反，椎管内注射MKC-231可通过增加脊髓ACh的释放以及抑制小胶质细胞活化而缓解避水应激诱导的疼痛反应。
结论：CHT1可通过增加脊髓ACh合成以及抑制脊髓后角小胶质细胞激活，在慢性应激性痛觉高敏的脊髓调控中发挥镇痛作用。MKC-231 是治疗痛觉高敏性疾病的潜在有效药物。
第三部分 高亲和力胆碱转运体CHT1对原代培养海马神经元和小胶质细胞的影响
背景：神经元-小胶质细胞相互作用参与了痛觉高敏的调控过程，而胆碱能系统在该过程中起重要作用。高亲和力胆碱转运体CHT1介导的胆碱摄取及转运是胆碱能循环的限速步骤。然而，CHT1对神经元及小胶质细胞功能的影响尚不明确。
目的：旨在探讨高亲和力胆碱转运体CHT1是否参与神经元及小胶质细胞功能的调控。
材料和方法：取孕16-18d的SD孕鼠及出生1-3d的SD仔鼠分别行海马神经元原代培养和大脑皮层小胶质细胞原代培养，倒置显微镜下观察细胞的生长状态，并行免疫荧光染色鉴定细胞纯度。通过脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）处理建立神经元及小胶质细胞的损伤模型。采用实时荧光定量 PCR、western blot及免疫荧光染色法确定培养物中CHT1的表达。ELISA法测定ACh的分泌，并评估胆碱摄取增强剂（MKC-231）对神经元及小胶质细胞培养物ACh分泌、神经生长因子（ nerve growth factor, NGF ）和原肌球蛋白相关激酶 A （tropomyosin-related kinase A, TrkA）等疼痛相关分子及IL-6等炎症因子的影响。
结果：采用本实验的细胞培养方法可成功培养原代神经元和小胶质细胞，且培养物的纯度和质量满足后续实验的要求。免疫荧光双染显示CHT1可在神经元和小胶质细胞中高表达。LPS处理可使海马神经元中CHT1和生长相关蛋白43 （ growth-associated protein 43, GAP43 ）的表达下降， TrkA 的表达增加，而MKC-231可部分逆转这些改变。此外，MKC-231处理还能进一步逆转LPS诱导的神经元ACh分泌减少。LPS处理可引起小胶质细胞培养物中IL-1β、TNF-α和NGF转录水平上调，同时使IL-4转录下调、p38磷酸化水平增加及ACh释放减少，而MKC-231处理可部分逆转上述改变。
结论：CHT1可通过影响ACh的合成、NGF/TrkA信号通路激活及神经元的生长对 LPS 诱导的神经元损伤和小胶质细胞激活起保护作用。这为神经炎症性疾病的治疗提供了新的靶标。