论文部分内容阅读
紫杉醇是一种二萜类的生物碱,最初从太平洋短叶红豆杉(Taxus brevifoliaNutt.)的树皮中分离到,研究发现紫杉醇对包括卵巢癌在内的多种癌症具有良好疗效。由于紫杉醇在树皮中含量很低并且提取过程繁琐,因而价格昂贵,很大程度上限制了紫杉醇的应用。随着紫杉醇的需求日益增长,紫杉醇的供求矛盾也日益突出,这促使人们尝试各种途径扩大紫杉醇的来源。自从1993年Stierle首次从红豆杉树皮中分离得到一株产紫杉醇真菌Taxomyces andreanae以来,越来越多的产紫杉醇内生真菌被分离出来,这为人们通过微生物发酵大规模工业生产紫杉醇提供了可能。本研究从安徽石台县仙寓山一株百年野生南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)树皮中,分离得到一株产紫杉醇重要前体物质巴卡亭Ⅲ的内生真菌。经过形态学和分子生物学鉴定,将该真菌鉴定为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.),并命名为TL9。通过单因素和4因素3水平正交实验确定了该真菌的最佳碳源和氮源,进而优化真菌的发酵培养基。以分离得到的真菌为材料,根据南方红豆杉紫杉醇合成途径关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10p-乙酰转移酶(DBAT)的基因dbat的序列(AY365031.2)设计引物,同源克隆得到一段长为706bp的片断,经BLAST序列比对确认为真菌dbat基因的核心片断,然后通过反向PCR技术,扩增得到一段长为753bp的片断,经过序列分析后与核心片断进行拼接,得到一段长为1281bp的片断。序列比对显示该片段与红豆杉植物dbat基因相似度达到97%,因此确认为真菌dbat基因的核心片断。以真菌TL9为材料,测定真菌的生长曲线,确定处于对数生长期中期(约4天左右)为制备原生质体的最佳时间。通过选择合适的酶,调整酶的作用温度和作用时间,优化原生质体的制备流程。以潮霉素B为筛选剂,确定潮霉素B浓度150ug/L适合作为真菌TL9遗传转化的筛选压浓度。以pCAMBIA1304和真菌表达载体pAN7-1为材料,构建了以潮霉素抗性基因为筛选标记适合用于根癌农杆菌转化的双元载体,并转化根癌农杆菌。以真菌TL9的原生质体为受体,考察了培养支持物、根癌农杆菌菌株、AS添加方式、AS浓度、原生质体浓度、根癌农杆菌的浓度、共培养条件等多方面因素,确定了适合该真菌的农杆菌转化条件,从而建立了根癌农杆菌介导的该真菌原生质体转化平台,最高转化率约为55个转化子/107个原生质体,并且潮霉素抗性稳定遗传。根据南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)紫杉醇合成途径紫杉二烯合酶(Taxadiene synthase, TS),10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10p-乙酰转移酶(10-deacetyl-baccatinⅢ-10β-O-acetyltransferase,DBAT),3-氨基-3-苯基丙酰转移酶(3-amino-3-phenylpropanoyltransferase, BAPT)三个关键酶的基因序列设计引物,构建了紫杉醇合成途径关键酶基因真菌表达载体pTS, pDBAT, pBAPT,转化真菌TL9原生质体。检测结果表明,dbat基因转化产巴卡亭Ⅲ内生真菌TL9能够提高真菌巴卡亭Ⅲ的含量,dbat基因RNA的表达水平分析结果表明dbat基因表达量水平与真菌巴卡亭Ⅲ有较为明显的对应关系。本研究为以后利用基因工程手段提高内生真菌紫杉烷类化合物含量打下了基础,并对在分子水平上理解内生真菌紫杉醇合成途径具有参考意义。