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由于能源、资源和环境问题的日益突出,以生物质为底物经微生物转化为生物燃料及高附加值产品以其经济、环保及可再生等优势成为研究热点。我国是一个农业大国,木质纤维素储量特别丰富,若水解不完全,可获得发酵性的纤维二糖、葡萄糖和木糖;若完全水解则获得葡萄糖和木糖（质量比约为2:1）。绿色生物制造的经济性取决于生物催化剂能否高效共利用木质纤维素水解产生的纤维二糖、葡萄糖和木糖。实验室自主筛选的嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27,SCUT27）能实现葡萄糖和木糖、木糖和纤维二糖的共利用,但不能共利用葡萄糖和纤维二糖。虽然SCUT27能共利用木糖和葡萄糖,但木糖利用速率显著低于葡萄糖利用速率。本论文基于课题组前期对SCUT27在不同碳源下及不同时间段的转录组测序及数据分析,以期通过关键基因或调控因子的挖掘及相应代谢工程改造,改善SCUT27底物利用,提高乙醇产量。SCUT27不能共利用葡萄糖和纤维二糖,其机制为非CcpA（Catabolite Control Protein A,CcpA）依赖的碳代谢阻遏。对SCUT27基因组数据进行挖掘,找到四个注释为纤维二糖利用相关基因簇,并命名为Cel1、Cel2、Cel3和Cel4。RT-PCR结果表明:仅Cel2包含PTS转运蛋白和糖苷水解酶基因,具有完整元件用于纤维二糖代谢的操纵子。经软件预测,发现Cel2启动子是诱导型启动子,受σ54和转录激活因子CelRcel2协同激活。将该启动子连同celRcel2被adhE（V5180444）的强启动子替换,实现Cel2组成型表达,SCUT27/ΔcelRcel2/padhE成功解除葡萄糖对纤维二糖的代谢阻遏,实现二者共利用。还原力感应蛋白（Redox sensing protein,Rex）能感应胞内NADH/NAD+含量变化,从而调控下游基因表达,是一个全局性转录调控因子。在SCUT27基因组中,坐标为V5182238的基因被注释为rex。当敲除rex后,以葡萄糖、木糖及二者混合糖分别培养,与SCUT27相比,SCUT27/△rex最大OD600增加95.36%-103.16%,乙醇得率提高63.16%-88.23%,乙酸和乳酸得率下降44.44%-60.98%,底物利用速率提高74.19%-130.56%。以上结果表明,rex缺失后,工程菌通过代谢合成扰动,改变了碳代谢流的分配,重塑并形成新的、稳定的氧化还原平衡,促进底物利用及乙醇生产。为进一步提高乙醇得率,构建工程菌SCUT27/Δldh/Δrex,其乙醇产量和产率分别从～4.56 g/L和0.32 g/g增加到7.45 g/L和0.38 g/g。以多种廉价底物水解液为底物,与SCUT27/Δldh相比,SCUT27/△ldh△rex耐受水解液毒性的能力显著提高,特别是以小麦杆水解液为底物时,乙醇浓度提高37.08%,乙醇产率提高36.67%。精氨酸阻遏蛋白（Arginine repressor,ArgR）是与精氨酸代谢相关的调控蛋白,也具有全局性转录调控功能。在SCUT27基因组中,有三个基因被注释为ArgR。基因敲除及发酵测试结果表明:仅argR1864敲除能显著提高SCUT27底物利用（葡萄糖利用速率提高～38.46%,木糖利用速率提高～50.00%）并影响代谢产物分配,碳源倾向于流向菌体生长（菌体摩尔得率提高～31.82%）,乙醇生产（乙醇摩尔得率提高～82.95%）和乙酸生成（乙酸摩尔得率提高～40.00%）,即argR1864敲除不仅强化SCUT27底物利用,而且提高乙醇生产。以廉价底物稀酸水解液进行发酵测试,与SCUT27相比,SCUT27/△argR1864木糖利用速率提高25.00%-62.96%,葡萄糖利用速率提高21.43%-118.75%,乙醇浓度和产率分别显著提高 113.86%-760.00%和 88.89%-400.00%。结果表明,敲除argR1864是改造SCUT27利用廉价底物水解液进行乙醇生产的有效策略。以木糖为碳源对SCUT27/ΔargR1864进行转录组测序,深入探讨ArgR的生理功能。结果表明,ArgR1864既是精氨酸代谢相关基因转录的负调控因子,也是热激蛋白相关基因表达的负调控因子。平板点样实验、胞内活性氧含量（Reactive Oxygen Species,ROS）ROS)测定及廉价底物抑制剂耐受实验皆证明工程菌SCUT27/ΔargR1864对外界环境胁迫具有较强耐受。以廉价底物酶解液进行发酵,与SCUT27相比,SCUT27/ΔargR1864糖耗速率提高52.88%-84.62%,乙醇产量提高117.55%-186.96%,这与以廉价底物酸水解液中SCUT27/ΔargR1864的发酵表型一致。表明,SCUT27/△argR1864的发酵性能在各种木质纤维素水解液中皆非常稳定。综上所述,SCUT27葡萄糖和纤维二糖的代谢阻遏为非CcpA依赖的碳代谢阻遏,操纵子Cel2的启动子受σ54和转录激活因子CelRcel2的协同激活,通过启动子替换获得工程菌SCUT27/ΔcelRcel2/padhE,实现葡萄糖和纤维二糖的共利用。Rex和ArgR1864是SCUT27的转录调控因子,通过基因敲除,均能引起SCUT27代谢合成扰动,建立新的、稳定的碳代谢流分配,促进底物利用及乙醇生产。