结核病(tuberculosis, TB)仍然是世界范围内最严重的致死性疾病之一,全球约有1/3的人口感染结核杆菌,2012年新发的活动性结核病人有860万人,并且有近130万人死于结核病,严重威胁人类健康和公共卫生安全。目前用于预防TB的唯一疫苗仍是卡介苗(Calmette-Guerin, BCG),但其免疫保护效果不佳,尤其针对成年人的肺结核,其免疫效果因地域不同呈现明显差异(0%～80%)。一方面,非结核分枝杆菌的感染干扰了BCG的作用；另一方面,在传代减毒过程中,BCG丢失了编码保护性抗原的基因序列,例如缺失了差异区域(region of difference, RD);此外,BCG作为一种减毒活疫苗,对于免疫力低下的人群,接种后将存在引发播散性结核病的隐患。因此更加理性地设计高效、安全的新型TB疫苗及寻求更为合理的抗TB免疫策略是亟待解决的研究课题,而这些都需要免疫学基础上强有力的支撑,需要充分理解结核分枝杆菌的致病机理和免疫生物学特性,而寻找可以诱导机体产生保护性免疫应答的结核分枝杆菌蛋白、多肽是研发各种新型疫苗的基础。1.结核分枝杆菌ESX-5分泌系统生物信息学分析Ⅶ型分泌系统是近年来在结核分枝杆菌中发现的一种新型细菌分泌系统,由一些独特的蛋白组分构成,所有的分泌蛋白在分泌时彼此依赖,并且通过特定的途径得以分泌。本研究对Ⅶ型分泌系统中的ESX-5分泌系统进行了生物信息学分析,直系同源搜索结果表明,在61株已测序的分枝杆菌中,耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、罗得西亚分枝杆菌(Mycobacterium rhodesiae)、楚布分分枝杆菌(Mycobacterium chubuense)、马赛分枝杆菌(Mycobacterium massiliense)和新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)等6株分枝杆菌不含有ESX-5组分中任一蛋白的直系同源物,有48株分枝杆菌含有7个以上ESX-5蛋白组分,其中有46株分枝杆菌含有11个以上ESX-5蛋白组分,通过分析每个蛋白组分在不同菌株的存在情况,发现Rv1787-Rv1792这个区段不是ESX-5分泌系统的核心组分；聚类分析结果显示,Rv1786、Rv1787、 Rv1788、Rv1789、Rv1791、Rv1793等6个相邻的组分属于相同的聚类,Rv1782、Rv1783、 Rv1794、Rv1795、Rv1796、Rvl797、Rv1798等7个组分属于相同的聚类,而Rv1785c、 Rv1790、Rv1792这3个组分各为一类；Rv1782、Rv1783、Rv1795、Rv1796、Rv1797等蛋白含有跨膜螺旋；Rv1788、Rv1791、Rv1796等蛋白含有信号肽；Rv1782、Rv1783、 Rv1785c、Rv1787、Rv1789、Rv1790、Rv1796、Rv1798等蛋白具有糖基化位点；Rv1796 (MycP5)是枯草杆菌丝氨酸蛋白酶,其酶解底物可能为Rv1795。这些数据将有助于对结核分枝杆菌ESX-5分泌机制的深入研究,为结核病的预防、诊断和治疗提供理论依据。2.结核分枝杆菌ESX-5分泌系统内PPE25和PE19蛋白T细胞表位的鉴定结核分枝杆菌标准株H37Rv和缺失株H37Rv△ppe25-pe19尾部皮下免疫6周龄C57BL/6小鼠,免疫剂量为1×106CFU/只,同时以未免疫小鼠为阴性对照,免疫3周后分离小鼠脾脏并制备脾细胞悬液,1×105cells/well铺入96孔细胞培养板中。以合成多肽库中的单个多肽分别刺激脾细胞进行PEPSCAN实验(其中PPE25肽库包括71条15肽,重叠数目为5个氨基酸；PE19肽库包括29条15肽,重叠数目为3个氨基酸重叠),多肽终浓度为1Oμg/ml,刺激72h后ELISA方法测定细胞上清中IFN-γ含量。通过表位作图的方法共鉴定出PPE25蛋白包括PPE25:1-20、PPE25:41-65、PPE25:186-200、PPE25:201-215、 PPE25:236-255.PPE25:281-295和PPE25：321-335等T细胞表位,其中PPE25:236-255、 PPE25:281-295和PPE25：321-335是ESX-5分泌系统相关PPE蛋白的特异表位。PE19蛋白包括PE19:1-18、PE19:34-51和PE19：82-99等T细胞表位,其中PE19：1-18为ESX-5分泌系统相关PE蛋白的特异表位。这将为新一代疫苗设计和诊断试剂研发提供可靠的试验依据,为后期的工作奠定坚实的基础。3.结核分枝杆菌PPE26蛋白MHC-IT细胞表位的鉴定与PPE26:44-52 CD8+T细胞杂交瘤的制备通过SYFPEITHI软件对结核分枝杆菌ESX-5区域内PE/PPE蛋白MHC-I T细胞表位进行预测,并对其中的PPE蛋白T细胞表位进行实验验证,在此基础上通过T细胞杂交瘤技术将转染了小鼠CD8分子的小鼠胸腺瘤细胞系BW5147-CD8与抗原特异的T细胞在PEG1500作用下融合,制备PPE26：44-52特异性的CD8+T细胞杂交瘤。经过HAT选择性培养基筛选后对生长出的细胞克隆进行鉴定,共检测136个细胞孔,仅有1E1、4A8和4D8三个克隆能够特异识别多肽进行抗原递呈实验,进一步验证1El、4A8和4D8三个克隆均为PPE26：44-52特异性的,且MHC限制性都为H-2Kd,这与预测结果一致。获得的杂交瘤细胞株将为定量测定APC上特定的MHC-肽复合物提供生物材料。4.结核分枝杆菌PPE25、PPE26、PPE27和PE19蛋白的原核表达及免疫生物学特性研究以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增ppe25, ppe26, ppe27和pe19基因,并将其克隆到表达载体中,重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示目的蛋白获得了成功表达,相对分子质量分别为40 kD、44 kD、41 kD和15 kD,目的蛋白主要以包涵体形式表达。对包涵体进行变复性后进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。Western blotting结果表明,重组蛋白均能与抗HIS单抗发生特异反应,表现出良好的反应原性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,能有效地刺激特异性抗体的产生,从而证明PPE25、PPE26、PPE27和PE19均具有较强的体液免疫原性,其中以PPE26诱导产生抗体的能力最强。进一步实验证实,PPE25/27:56-71、PPE26:370-385和PE19：56-71是相关蛋白的优势B细胞表位。结核病人的外周血单核细胞经PPE25/PPE26/ PPE27蛋白混合物或者PE19蛋白刺激后,均能引起抗原特异的IFN-γ、IL-2、TNF-α等细胞因子分泌,从而说明融合蛋白具有细胞免疫原性。本研究将为探索PPE25、PPE26、PPE27和PE19蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制等方面的潜能奠定基础。