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葡萄糖氧化酶(GOD)是专一性氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢的氧化还原酶,过氧化氢酶(CAT)则以过氧化氢为唯一底物水解生成水和氧气,将耦合反应的两种酶共固定化一直是研究热点。葡萄糖酸是在食品、医药和化工等领域广泛应用的有机酸,主要是以发酵法、化学法、电解氧化和酶催化四种方法制备。与酶催化相比,其他3种都存在转化率低、成本高、副产物多等缺点,酶法制备具有反应条件温和、产品纯度高、制备周期短等优点。通过共固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶氧化葡萄糖制备葡萄糖酸,对实现酶的重复利用,将酶催化的高效率、安全和环境友好等优势应用于现代有机酸生产具有重要的研究价值。本文首先综述了共固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的研究进展,其次采用(PVA)-海藻酸钠(SA)复合载体和交联酶聚集(CLEAs)两种方法共固定化葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶。在此研究基础上,结合两种固定化酶理化特性,分别利用鼓泡式和机械搅拌式生物反应器制备葡萄糖酸,为酶法制备葡萄糖酸规模化生产提供了参考依据。主要研究内容如下：1.通过制备PVA-SA复合载体,优化制备工艺,并对固定化酶酶学性质进行了研究。得到最佳制备条件为：酶活力添加比例CAT:GOD=10:1,酶液质量浓度为10mg/mL,载体比例为PVA:SA=9.0:1.5,最终葡萄糖氧化酶酶活保留率90%。双酶共固定化后,其耐酸和热稳定性较游离酶均有较大提高。扫描电镜(SEM)观测固定化酶微观结构,固定化酶颗粒孔径均匀,内外相连,结构良好。2.以共固定化酶为催化体,利用鼓泡式反应器传质速率高、对酶损伤小的特点,探索酶法制备葡萄糖酸条件。为了减弱底物抑制作用,采用离子交换树脂原位分离产生的葡萄糖酸。最终葡萄糖转化率90%。用盐酸洗脱葡萄糖酸,洗脱液葡萄糖酸浓度为85.7g/L,取得了良好的应用效果。3.运用无载体固定化方法-交联聚集体,制备复合GOD-CAT交联酶聚集体,优化了制备条件,并对交联酶聚集体酶学性质进行了研究。得到制备条件为：酶活力添加比例为CAT:GOD=5:1,1.5倍体积乙醇进行沉淀,保护剂PEG20001.0%(w/v),戊二醛2.5%(v/v),交联时间2h,最终葡萄糖氧化酶酶活保留率近80%。双酶共交联后,耐酸性显著提高。但是催化环境温度高于60℃时,CLEAs失活加速。SEM观察微观形貌,CLEAs大小在70μm左右,结构稳定。4.采用复合GOD-CAT交联酶聚集体为催化体系,使用机械搅拌式生物反应器,氧化葡萄糖制备葡萄糖酸。通过正交实验对酶催化条件进行优化,结果证明加酶量和底物浓度对制备效率影响较大。利用发酵罐进行放大实验,最终反应液葡萄糖酸浓度145.8g/L,表明复合交联酶聚集体对底物抑制作用能力较强,具有广阔的应用前景。