背景和目的近年来研究发现,肿瘤细胞能够对结构与药理机制完全不同的化疗药物产生广泛的耐药作用,从而在临床上由于肿瘤细胞逐渐丧失对化疗药物的敏感性,因此导致临床治疗失败。这种肿瘤细胞对化疗药物敏感性降低而产生抵抗的作用被称为肿瘤的多药耐药作用(Multi-drug resistance, MDR)。多药耐药作用主要由·肿瘤细胞对细胞膜上ATP结合盒(ATP binding cassette, ABC)转运体超家族的过表达引起,使得这些转运体底物药物由细胞内泵出至细胞外。其中,最为重要的是由MDR1基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp),其能够转运诸如蒽环类、长春碱类、紫杉烷类以及表鬼臼毒素类等多数抗肿瘤药物,从而,在多种人类肿瘤中引起了先天性与获得性的多药耐药作用。目前,P-gp介导的肿瘤多药耐药作用被证实可以通过屏蔽其药物外排泵功能以及抑制其蛋白表达来有效的抑制。因此,下调P-gp的功能与表达可以对P-gp相关的肿瘤多药耐药作用产生逆转,进而增加肿瘤对化疗药物的疗效。伴随发现了维拉帕米能够有效抑制P-gp作用,掀起了一场对于P-gp抑制剂研究与开发的潮流,采用化学方法合成了一系列能够抑制P-gp的化合物。然而,其多数需要在较高的浓度起效,同时伴随产生了严重的药物副反应并引起产生了化合物固有的细胞毒性,因此,与这些合成P-gp抑制相关的临床实验结果均不能令人满意。尽管一代又一代的P-gp抑制剂层出不穷,临床上仍然需要新的药物来克服由P-gp高表达产生的肿瘤药多药耐药作用。所以,越来越多的研究者将目光转移至有效但毒性小的天然小分子化合物,希望这些天然化合物可以作为一种抗肿瘤治疗补充剂参与到抗肿瘤增敏作用中。P-gp/MDR1在多种肿瘤细胞中被广泛研究,其中包括人卵巢癌细胞A2780以及其紫杉醇耐药细胞亚系A2780/T细胞。从分子机制上来说,影响P-gp表达的相关信号通路包括NF-κB、MAPK、PI3、COX-2以及ROS通路等。在这些涉及P-gp表达的通路中,NF-κB与MAPK通路又与肿瘤细胞的增殖、凋亡与转化密切相关。外界刺激因素通过激活IκB的磷酸化从而引起IκB的泛素化,导致IκB的降解,因此在胞浆中释放出NF-κB,胞浆中游离的NF-κB又通过复杂的调节方式进入到细胞核内,参与调节其下游相关基因与蛋白启动子的活性。在P-gp/MDR1启动子-159区域包含了NF-κB的结合位点。因此,NF-κB激活的降低,使得进入到细胞核内结合到MDR1启动子中的NFκkB减少从而降低P-gp的过表达,这是P-gp下调的一条重要的通路机制。此外,在P-gp/MDR1启动子-168区域包含了YB-1的结合位点,而MAPK/ERK(?)能够通过其磷酸化作用的激活从而激活YB-1的核转位,既而调节P-gp的表达。说明MAPK/ERK的磷酸化,同样促使P-gp表达上调。并且,MAPK通路中另外两条主要亚通路——JNK以及p38通路同样可以通过其磷酸化作用的激活来调节P-gp的表达。迄今为止,关于天然黄酮类多酚化合物是否可以通过调节NF-κB通路的激活与MAPK/ERK介导的YB-1来逆转多药耐药作用仍未见相关的研究报道。此外,有报道表明,microRNA中niR-27a与miR-451能够调节P-gp的表达,而关于天然化合物是否能够通过调节microRNA的表达从而抑制P-gp的表达尚无报道。原花青素(Grape seed procyanidin,GSP)是一类在自然界中广泛存在于水果、蔬菜、果仁、种子、花及树皮中,具有强大的抗菌、抗炎、抗过敏与抗氧化作用的黄酮类多酚化合物。以原花青素作为主要有效成分的保健品碧萝芷广泛用于以食物补充剂的形式进行抗炎与治疗创伤的辅助治疗。近年来,有研究报道原花青素能够抑制P-gp在血脑屏障中的功能,但原花青素是否能够通过抑制P-gp从而逆转肿瘤多药耐药作用及其逆转机制尚未见相关研究。因此,本课题通过研究原花青素是否能够增加紫杉醇与阿霉素在多药耐药细胞中的细胞毒性并且抑制P-gp/MDR1的表达与转录水平从而逆转肿瘤多药耐药作用；进一步探讨原花青素抑制P-gp表达与其参与调节P-gp表达相关的microRNA、抑制NF-κB激活以及MAPK/ERK通路介导的YB-1活性的相关性,从而揭示原花青素可能作为一种抗肿瘤增敏剂产生逆转多药耐药作用的机制。内容和结果通过RT-PCR与Western blot法验证A2780与A2780/T细胞在P-gp/MDR1表达上的差异性,结果表明A2780/T在P-gp/MDR1mRNA与蛋白水平显著高表达。此外,采用MTT法评价A2780/T与A2780细胞对紫杉醇与阿霉素的半数抑制浓度结果显示,紫杉醇(100.36±1.68μmol/L vs.0.23±0.02μmol/L)与阿霉素(15.08±0.39pμmol/L vs.0.65±0.02μmol/L)在A2780/T细胞中的IC50显著高于A2780细胞。采用MTT法评价原花青素对紫杉醇与阿霉素在A2780与A2780/T细胞中细胞毒性的影响。以不同浓度的原花青素(0～40μmol/L)与不同浓度梯度的紫杉醇(A2780:0～20μmol/L; A2780/T:0～100μmol/L)及阿霉素(A2780:0～8μmol/L; A2780/T:0～80μmol/L)共同刺激A2780与A2780/T细胞48h。实验中40μmol/L的维拉帕米作为阳性对照药物,MTT结果数据计算出细胞生存指数及紫杉醇或阿霉素的IC50,以均数±标准差(x±s)表示,统计学分析使用SPSS13.0软件进行,其中生存指数间比较采用析因设计的方差分析,IC50的比较采用随机设计的方差分析,方差齐情况下的组间比较采用LSD或S N K检验,方差不齐情况下的组间比较采用Dunnett检验。结果表明,10～40μmol/L的原花青素能够显著降低紫杉醇(F=93.416,P<0.001)与阿霉素(F=74.057,P<0.001)对A2780/T细胞的生存指数,而对A2780细胞没有显著影响(F=0.412,P=0.799；F=2.219,P=0.078)。此外,原花青素显著降低了紫杉醇(F=309.051,P<0.001)与阿霉素(F=118.655,P<0.001)在A2780/T细胞的IC50,而对A2780细胞IC50的影响没有统计学意义(F=0.490, P=0.744; F=0.0610, P=0.992)。P-gp表达水平评价方面,以RT-PCR与Western blot技术分别对原花青素在A2780/T细胞中对P-gp/MDRl mRNA与蛋白水平表达的影响进行评价。A2780/T细胞分别以0～40μmol/L的原花青素刺激48h或以40μmol/L的原花青素刺激0～48h, RT-PCR结果以2-ΔΔct法分析,Western blot条带灰度值以归一化法处理数据,以均数±标准差(x±s)表示,采用随机设计方差分析进行数据分析,方差齐情况下的组间比较采用LSD或SNK检验,方差不齐情况下的组间比较采用Dunnett检验。结果表明,原花青素能够显著抑制MDR1mRNA的表达水平,这种抑制作用具有浓度依赖性(F=7.621,P=0.006)与时间依赖性(F=11.222,P=0.001)；同时,原花青素能够显著抑制P-gp的蛋白表达水平,同样具有浓度依赖性(F=149.594,P<0.001)与时间依赖性(F=591.477,P<0.001)。P-gp功能评价方面,分别采用R123累积实验与P-gp ATP酶活性检测。原花青素(0～40μmol/L)刺激A2780与A2780/T细胞2h后,加入10μmol/L的罗丹明123(Rhodamine123, R123)孵育2h,以多功能酶标仪检测细胞内R123的荧光强度；采用Pgp-GloTM Assay Systems试剂盒检测P-gp ATP酶的活性,通过原花青素(0～40μmol/L)或原钒酸钠与重组P-gp膜孵育后消耗加入的ATP,以ATP检测试剂产生的化学发光检测ATP的剩余量。采用随机设计方差分析进行数据分析,方差齐情况下的组间比较采用LSD或S-N-K检验,方差不齐情况下的组间比较采用Dunnett检验。结果表明,原花青素能够浓度依赖的增加R123在A2780/T细胞中的积累(F=64.228,P<0.001)而对R123在A2780细胞中的累积没有影响(F=0.958,P=0.471)。此外,2.5～40μmol/L的原花青素能够浓度依赖的抑制P-gP ATP酶的活性,表现为增加了反应体系中ATP的剩余量。建立Stem-loop PCR检测miR-27a与miR-451的方法,并以该方法评价不同浓度原花青素(0～40μmol/L)与原花青素(40μmol/L)刺激不同时间(0-48h)对A2780/T细胞中miR-27a与miR-451表达的影响。通过随机设计方差分析比较结果显示,原花青素能够浓度与时间依赖的显著抑制miR-27a(F=54.553, P<O.001；F=107.670,P<0.001)与miR-451(F=75.339,P<0.001；F=92.757, P<0.001)在A2780/T细胞中的表达。采用Western blot法与免疫荧光技术评价原花青素对P-gp表达的抑制与NF-κB的相关性。原花青素(0-40μmol/L)刺激A2780/T细胞24h或40μmol/L的原花青刺激细胞0-12h后,随机设计方差分析结果表明,伴随着P-gp表达的显著下调(F=41.230,P<0.001:F=32.212,P<0.001),原花青素分别浓度依赖与时间依赖的显著抑制了AKT(F=598.126,P<0.001:F=149.594,P<0.001)与IκBα(F=599.284,P<0.001:F=373.460,P<0.001)的磷酸化水平,并上调了IκB蛋白的表达水平(F=717.144,P<0.001:F=291.728,P<0.001).进一步,评价原花青素对脂多糖(LPS)诱导的NF-κB激活是否存在抑制作用。结果表明,1μg/ml的LPS在上调P-gp的基础上显著上调了AKT、IκBα的磷酸化水平并下调了IκBα的表达水平。以随机设计方差分析比较原花青素对LPS诱导NF-κB的抑制作用,结果表明,原花青素(0～40μmol/L)预刺激A2780/T细胞6h以及40μmol/L的原花青素预刺激细胞0-6h均能显著抑制LPS对NF-κB的激活作用,表现为显著抑制LPS上调的P-gp表达的同时抑制了LPS上调的AKT与IκBα的磷酸化水平,并上调了LPS下调的IκBα的蛋白表达水平。通过分离A2780/T细胞核／浆蛋白检测NF-κB3(p65)在核蛋白与胞浆蛋白中的表达,表明原花青素能够浓度与时间依赖的抑制p65在核蛋白中的表达并增强其在胞浆蛋白中的表达。此外,原花青素能够浓度与时间依赖的抑制由LPS诱导的p65在细胞核中的高表达以及p65在胞浆中的低表达。原花青素对NF-κB的激活抑制作用表现出了与NF-κB抑制剂PDTC相类似的趋势。免疫荧光结果表明,原花青素能够显著抑制由LPS及核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的NF-κB (p65)的核转位。另一方面,通过Western blot方法评价原花青素抑制P-gp表达与MAPK通路以及MAPK/ERK介导的YB-1活性的影响。结果表明,原花青素能够抑制A2780/T细胞中ERK1/2、JNK以及p38的磷酸化并能抑制YB-1的核转位,其中,对ERK1/2磷酸化及YB-1核转位的抑制具有浓度与时间依赖性,表明原花青素能够抑制MAPK/ERK介导的YB-1的活性。进一步,为了证实MAPK通路在原花青素对MDR1表达抑制中的作用,采用LPS诱导MAPK/ERK通路激活。A2780/T细胞先以0-40pmol/L的原花青素孵育6h或以40μmol/L原花青素细胞0-6h,再加入1μg/ml的LPS刺激30min,结果表明,LPS显著活性了MAPK/ERK通路。随机设计方差分析结果表明,各种孵育方法下的原花青素均能显著抑制LPS诱导的ERK1/2的磷酸化,并能显著抑制YB-1的核转位。在实验中原花青素表现出了与阳性对照药物ERK1/2的抑制剂U1026相类似的趋势。这些结果表明原花青素通过抑制MAPK/ERK通路来阻滞YB-1的激活,从而抑制MDR1的表达。讨论和结论P-gp由定位在7,q21.1染色体上的MDR1基因编码,在众多肿瘤细胞所产生的多药耐药作用中起到核心作用。P-gp在卵巢癌在内的多种肿瘤细胞高表达,因此降低了化疗药物对肿瘤的疗效,最终使得治疗失败。已有报道证明,抑制P-gp能够增强化疗药物在多药耐药患者中的治疗作用。但随着越来越多新的P-gp抑制剂的开发,尽管部分化合物在体外有效,由于其体内无效以及存在不可预期的副反应,所以临床实验结果均不能令人满意。基于食源性成分的低毒性,研究者将研究目光转向天然植物来源化合物。研究表明原花青素具有食源性、低毒性,并具有强大的抗氧化作用等药理活性。同时,研究发现原花青素能够通过抑制P-gp的功能从而逆转血脑屏障中的多药耐药作用,但是,原花青素是否能够抑制肿瘤细胞中的多药耐药性及其机制仍不清楚。此外,尚无关于原花青素抑制P-gp表达及其机制研究的报道。由于原花青素与能够抑制P-gp表达的黄酮类二聚体具有结构上的相似性,因此,有理由推测原花青素可以通过抑制P-gp的表达来逆转肿瘤多药耐药作用。另一方面,文献报道原花青素能够通过NF-κB与MAPK通路来抑制上皮间质化作用,并且NF-κB与MAPK与P-gp表达存在相关性,然而,原花青素是否能够通过NF-κB与MAPK/ERK通路抑制P-gp的表达不得而知。此外,YB-1与P-gp的共表达被认为是卵巢癌预后不良的标志,而YB-1在原花青素调节P-gp表达中的作用同样未见报道。因此,本课题首次研究了原花青素是否能够通过抑制P-gp的表达与功能从而逆转肿瘤细胞的多药耐药作用。结果表明,原花青素能够显著增强紫杉醇在P-gp过表达紫杉醇耐药细胞株中的细胞毒性,说明原花青素能够逆转由P-gp介导的肿瘤多药耐药。与此类似,原花青素还能够增强阿霉素在A2780/T细胞中的细胞毒性,说明原花青素增加紫杉醇的细胞毒性是对多药耐药作用的逆转而不是一种特异性药物相互作用。同时,原花青素显著增加了A2780/T细胞内R123的累积,从而抑制了P-gp的功能。进一步,正如前先预测,原花青素从mRNA水平与蛋白水平两个方面抑制了P-gp/MDR1的表达。原花青素还能够抑制MDR1启动子的转录活性以及由紫杉醇诱导的MDR1启动子转录活性的激活。这些结果充分证明原花青素能够抑制MDR1的转录水平。P-gp/MDR1在转录与翻译水平的降低被认为是化合物逆转多药耐药表型的机制之一,因此原花青素通过部分抑制MDR1的转录与翻译水平来逆转肿瘤细胞多药耐药表型,结果降低了P-gp的表达与功能。NF-κB二聚体由p65与p50亚基组成,其在胞浆中静息的分布与其抑制分子IκB家族的存在有关。以LPS及RANKL刺激细胞能够使其抑制分子IκBα产生磷酸化,导致产生泛素化以及蛋白酶介导的降低,并释放出活化的NF-κB分子。而且,AKT的磷酸化能够调节IκBα的磷酸化,从而激活NF-κB通路。NF-κB激活由胞浆进入细胞核,通过与MDR1启动子区域响应元件结合从而诱导MDR1的转录活性,进而诱导P-gp的表达。目前的研究在于评价NF-κB的激活在原花青素抑制P-gp表达中可能的作用。首先,原花青素表现出通过抑制AKT及IκBα磷酸化并上调NF-κB抑制剂IκBα表达水平来抑制NF-κB通路的作用。并且,原花青素能够伴随p65在胞浆的表达的增加的同时降低p65在核蛋白的表达,从而降低p65对MDR1启动子转录活性的激活作用。此外,原花青素阻滞了LPS与RANKL对NF-κB核转位的诱导。这些发现表明原花青素对NF-κB的抑制可能与其抑制P-gp的表达有关。另一方面,作为肿瘤转录/翻译因子,YB-1在多种类型肿瘤中高表达。先前的研究表明YB-1由AKT激活,并且MAPK/ERK的激活使YB-1产生核转位作用,导致其影响MDR1的表达。另外,有报道指出MDR1可能通过MAPK/ERK被胞外信号激活。本课题中,原花青素在其抑制P-gp表达的同时降低了JNK、p38与ERK1/2的磷酸化并抑制了YB-1的核转位。进一步,有研究表明ERK特异性抑制剂能够显著抑制P-gp介导的多药耐药作用。因此,推测原花青素抑制P-gp的表达与其下调MAPK/ERK通路有关。为了验证这种假设,引入LPS来诱导P-gp、MAPK/ERK以及YB-1的激活,从而证明原花青素是否能够像ERK的抑制剂U1026一样弱化诱导的ERK磷酸化。课题研究发现,原花青素减弱了LPS诱导的ERK1/2的磷酸化以及YB-1的核转位,这进一步证实了本课题的推测,表明原花青素抑制P-gp的表达受到YB-1的调节,部分通过调节MAPK/ERK的活性来实现。综上所述,目前的实验研究表明,原花青素能够通过抑制P-gp的功能、表达及转录活性来逆转多药耐药表型,从而增加紫杉醇与阿霉素在A2780/T细胞中的疗效。而且,原花青素能够抑制NF-κB的活性以及MAPK/ERK通路介导的YB-1的核转位,这可能与P-gp表达的下调有关。尽管本课题探讨了原花青素抑制P-gp的可能的机制,但仍未发现原花青素通过NF-κB以及MAPK/ERK通路与P-gp相互作用的特异性靶分子。此外,本课题研究仅将研究范围限定在了体外人卵巢癌细胞A2780与A2780/T。在下一步的研究中,值得进一步研究原花青素是否能够在其他卵巢癌细胞或其他肿瘤细胞模型以及体内实现对P-gp介导的肿瘤多药耐药作用的逆转。