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土壤次生盐渍化是设施蔬菜生产的主要障碍因子之一,严重制约了设施蔬菜的可持续发展。研究表明,次生盐渍化土壤中阴离子主要是NO3-。一氧化氮(NO)是一种在植物种子萌发、生长发育、抵抗生物和非生物胁迫过程中起重要作用的信号分子。植物非共生血红蛋白(nsHb)和S-亚硝基谷胱甘肽还原酶(GSNOR)在NO的代谢方面发挥重要作用。本论文主要对菠菜SoHb和SoGSNOR基因在硝酸盐胁迫下的功能和表达进行研究,取得结果如下:1 研究了外源施加NO供体硝普钠(SNP)对硝酸盐胁迫下两个菠菜品种(抗性品种’超级菠菜’,CJ)和盐敏感品种’大叶菠菜’,DY)的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species,RNS)代谢的影响。结果表明,高浓度的硝酸盐抑制了菠菜的生长,其鲜重和干重下降,膜脂过氧化程度加重、H2O2含量增加。外源施加SNP后,与硝酸盐胁迫相比,两品种菠菜ROS含量降低,CJ中ROS含量低于DY。硝酸盐胁迫下,两品种菠菜中SOD及POD活性升高,CAT、APX和GR活性降低,当添加SNP后,抗氧化物酶活性均升高,添加NO抑制剂及清除剂后,抗氧化物酶活性均下降。硝酸盐胁迫下,两品种菠菜NR活性降低,NOS活性升高,当添加SNP后,NR活性显著降低,NOS活性升高,硝酸盐处理可增加根尖NO含量,外源添加SNP后,根尖NO含量增加,加入抑制剂或清除剂后,NO含量降低,硝酸盐胁迫及添加SNP后两品种菠菜中SNO含量升高,而添加NO清除剂后SNO含量均降低,添加NO抑制剂后CJ中SNO含量降低,DY中则升高。2构建原核表达载体pET32a-SoHb,并转化大肠杆菌BL21star(DE3)获得原核表达工程菌株。通过IPTG法诱导该重组质粒在大肠杆菌中得到高效表达,融合蛋白分子质量约为38 kDa,且在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经Ni2+NTA亲和柱纯化,获得纯化的融合蛋白。与空载体相比,重组菌对NO耐受性增强。以纯化的融合蛋白为抗原免疫昆明小鼠,制备多克隆抗体,并对其进行了 western blot 检测。3对前期获得的SoHb过表达转基因拟南芥进行了硝酸盐和SNP的抗性分析。结果表明:在硝酸盐胁迫后,SoHb过表达转基因拟南芥植株生长受到明显抑制,根长变短,鲜重下降,NO含量降低,MDA含量升高,Fv/Fm降低,抗氧化物酶活性降低和基因表达量减弱,盐胁迫相关基因RD22,RD27A,DREB2A,P5CS1表达量降低,表明过量表达SoHb降低了植株对硝酸盐的耐受性。不同浓度SNP处理转基因植株后,转基因植株根长和鲜重大于野生型植株,转基因株系中NO含量低于野生型,表明过表达SoHb提高了植株对NO的耐受性。此外,转基因植株开花提前,开花相关的基因CO、SOC、FT、FLC、GI表达量增加。4克隆获得SoGSNOR基因全长序列,对该基因进行同源比对发现与其他物种GSNOR具有很高同源性。利用实时荧光定量PCR和western blot对硝酸盐胁迫及NO供体、抑制剂和清除剂处理下GSNOR基因及蛋白表达进行分析,结果表明硝酸盐胁迫及外源添加SNP后,GSNOR表达量下降,在添加L-NAME条件下,SoGSNOR表达量显著增高,当添加NO清除剂后,SoGSTNOR表达量显著下降。构建原核表达载体pET32a-SoGSNOR,通过IPTG诱导获得大约65kD的目的蛋白,利用Ni2+NTA亲和柱纯化蛋白,免疫小白鼠制备抗体。构建过表达植物表达载体pRI101-SoGSTNOR,并转化烟草,对转基因烟草检测获得转基因植株。此外,通过生物素转化方法分离纯化与硝酸盐胁迫相关的S-亚硝基化蛋白,质谱鉴定显示菠菜叶片中获得6个光合作用相关S-亚硝基化蛋白。