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c-myc是永生性癌基因,在细胞的生长、繁殖、凋亡及分化中具有极重要的地位。c-myc的过度表达是人类癌症细胞最常见的变化之一,是细胞恶性转化的关键基因。本研究用阳离子脂质体转染法首次将针对c-myc mRNA的SiRNA表达质粒pSilencer-c-myc转染人肺癌细胞A549,72h后收获细胞,RT-PCR检测结果表明,干扰细胞c-myc mRNA水平降低至40%左右,WestemBlotting分析表明其蛋白水平约降低了70%,说明RNA干扰成功。 应用流式细胞术研究c-myc表达水平降低对A549细胞周期的影响。结果表明,与对照细胞相比,RNA干扰72h后G0/G1期细胞比例由51.5±1.7%下降到35.1±1.1%,下降16个百分点,S期细胞由41.3±1.4%上升至55.1±1.6%,提高14个百分点,G2/M期则无明显差异(p>0.05),显示针对c-myc的RNA干扰引起S期阻滞。 为了探明c-myc RNAi引起S期阻滞的作用途径与机制,分析了细胞周期相关基因的mRNA水平,包括cyclin、CDK和CKI。试验结果显示,干扰72h后,干扰细胞与对照细胞比较:1) 细胞周期素cyclin D3、E、A的mRNA水平均出现不同程度的下降(p<0.05),分别下降了22±8%、30±2%和45±7%,cyclin D1则无明显变化(p>0.05);2) CDK2、CDK4 mRNA水平下调(p<0.05),分别下降了44±4%、39±4%;3) 细胞周期素依赖性抑制因子p21及p27的mRNA水平上升,各提高了36±6%、44±8%。 为了探明蛋白水平与mRNA水平的对应关系,运用WesternBlotting,分忻了Cyclin及CDK的蛋白水平。结果表明干扰72h后,干扰细胞与对照细胞比较,Cyclin D3、E、A,CDK2、4等的mRNA下调直接导致其蛋白水平的下降(p<0.05),分别下降42±5%、41±2%、57±5%和56±9%、36±5%。Cyclin D1无明显变化(p>0.05)。 综上所述,c-myc RNAi后,c-myc表达降低,对cyclin和CDK激活作用减弱,同时对CKI的抑制效应也降低,延缓DNA复制,引起细胞周期的S期阻滞,限制恶性癌细胞生长。因此c-myc的RNAi作为一种基因治疗手段,显示良好的前途。