海绵动物是最原始的多细胞动物,在长达6亿年的演化进程中,某些海绵演化出独特的类胶原蛋白——海绵硬蛋白。海绵硬蛋白是一种结构稳定、高度交联、多个纤维单体聚合的蛋白复合体,有耐强酸、耐高温、耐受酶解等特性。已有研究表明,海绵硬蛋白具有优秀的生物相容性、丰富错落的孔隙结构与耐腐蚀等优点,在组织修复支架、生物电极等生物材料应用领域颇具应用潜力。基于海绵硬蛋白的结构特征,本论文尝试探索该材料作为外伤创口止血敷料的可行性,为此开展了海绵硬蛋白的提取及其止血性能评价的研究,期望能挖掘出该材料更多的应用价值。本研究以沐浴角骨海绵为原料提取海绵硬蛋白,通过天狼猩红染色和羟脯氨酸含量追踪,确定了如下提取流程:首先通过盐酸、氢氧化钠分步去除杂质,获得不溶于水的海绵硬蛋白骨架(A组分,得率60.41%,羟脯氨酸含量3.36%)。将A组分用胰蛋白酶处理得到海绵硬蛋白材料,得率为36%,羟脯氨酸含量为5.67%。后续将该骨架进行冷冻研磨处理(70 Hz/s,15 min,-10℃),获得两种颗粒度明显差异的材料,其一为絮状,占比30%,其饱和吸水率为4050%,孔隙率为75.40%,电镜下纤维相连、网格均匀,将该材料编号为SX(难溶性海绵硬蛋白絮);其二呈粉末颗粒状,占比70%,其饱和吸水率为994%,孔隙率为90.46%,电镜下每个单体呈树枝状分叉,将该材料编号为SFM(难溶性海绵硬蛋白颗粒)。将A组分用过氧化氢溶解,透析、冷冻干燥后获得可溶于水的材料,得率为21%,羟脯氨酸含量为6.03%。该材料饱和吸水率362%,孔隙率为86.67%,电镜下呈片状,将其编号为SR(可溶性海绵硬蛋白)。通过傅里叶变换红外光谱分析表明SX和SFM材料的三螺旋结构保留完整,而SR材料的三螺旋结构可能发生解旋。从吸水性、孔隙率和微观分叉等物理参数上看,这三种海绵硬蛋白材料的止血效果可能有明显差异。将以上3种海绵硬蛋白材料进行体外凝血实验与动物实验,并以云南白药或I型胶原为正对照。体外凝血实验结果显示云南白药、I型胶原、SX、SFM与SR的凝血时间均值分别为151 s、167 s、235 s、118 s、194 s,空白组为222 s,表明SFM的止血性能显著优于其它组;大鼠断尾血液流失量的结果显示施加I型胶原、SX、SFM和SR止血处理的大鼠失血量分别为22.8 mg、22.3 mg、3.6 mg、28.1 mg,相较于空白组(93.1 mg)均有显著降低,其中SFM组的效果尤其显著;断尾止血时间结果显示施加I型胶原、SX、SFM、SR止血的断尾止血时间分别为714 s、371 s、129 s、697 s,而空白组在900 s后仍未凝血,这些结果表明3种海绵硬蛋白均有助于伤口止血,其中SFM尤其显著。本文继而开展了初步的止血机理探究。体外红细胞黏附实验显示海绵硬蛋白材料具备诱导细胞伪足迁移吸附、富集细胞的作用;血小板聚集实验显示海绵硬蛋白材料具备血小板聚集与激活、提供血栓支撑位点的作用;贫血小板血液的凝血实验显示SX和SFM材料具备使该缺陷血液发生凝血的能力;脱纤维血液的凝血实验显示SFM和SR材料具备使该缺陷血液发生凝血的能力。以上结果表明,海绵硬蛋白材料的凝血机理为材料本身能吸附红细胞与血小板,其丰富的树枝状分叉促进了纤维蛋白交联和血栓形成。SFM和SR材料可以令凝血因子缺陷血液发生凝血的机理则有待深入探索。而SFM材料之所以具有比其他两种海绵硬蛋白材料更出色的止血效果,推测是该材料颗粒小能充分接触伤口,其丰富的树枝状分叉又能促进血栓交联,所以能快速在整个伤口范围搭建交联成片的血栓而迅速止血。对SFM和SR材料进行生物相容性分析实验,结果表明这两种材料均不具有抗菌活性,但也不会促进细菌的滋生繁殖;材料的溶血率符合国家标准,对于皮肤无潜在刺激原,通过急性全身毒性实验证实它们无急性全身毒性反应。综上所述,通过本文的方法可以有效的提取沐浴角骨海绵硬蛋白。沐浴角骨海绵硬蛋白材料不仅具备有效的促凝血性能和良好的生物相容性,而且对凝血因子缺陷的特殊血液也有良好的止血能力,在新型止血材料领域具有巨大的开发潜力,尤其是SFM表现出相对于其他状态下的海绵硬蛋白材料具有更好的止血效果。后续研究以SFM材料为主体,进行进一步的止血功能和制备工艺研究将有希望获得止血新材料。