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哺乳动物羧酸酯酶（carboxylesterase,CES）是由多种同工酶组成的一个超家族（CES1～CES5）,在哺乳动物多种组织器官中广泛存在,通过催化水解含酯键、酰胺键和硫酯键的内外源性化合物,参与机体脂质代谢、药物和毒物代谢、炎症反应等生命活动,在生物体内发挥重要的生理学、病理学、药理学和毒理学作用。猪肝羧酸酯酶（pig liver esterases,PLE）属于CES家族成员,本课题组研究发现PLE在LPS诱导的炎症反应中发挥显著促炎作用,而PLE本身的表达水平又受到LPS负调节,提示PLE既是炎症反应的调节者,又是炎症反应负反馈调节的靶标,在炎症反应中具有关键的作用。关于PLE调节炎症的机制已得到充分的阐明,但LPS下调PLE表达的分子机制却不清楚,因此,本研究拟对此机制进行系统的研究,以全面揭示PLE在炎症反应中的地位和作用。本研究重点研究了作为典型PAMP的LPS及其诱导的主要促炎因子TNF-α/IL-1β下调PLE表达的分子机制,主要研究内容和结果如下:首先,在机体水平研究发现LPS诱导仔猪严重炎症反应的同时,猪肝脏、肾脏和肺脏中PLE m RNA和蛋白的表达显著下调;而PLE抑制剂BNPP预处理在大幅减轻炎症反应的同时,猪肝脏、肾脏和肺脏中PLE下调的程度随之减轻,提示LPS诱导的炎症反应中产生的促炎细胞因子（如TNF-α等）可下调PLE。已有研究表明LPS诱导的炎症反应可抑制孕烷X受体（pregnane X receptor,PXR）及其靶基因表达,而PXR可上调人和小鼠的CES表达,由此推测LPS诱导的炎症反应可能通过抑制PXR而下调PLE表达。故检测了上述试验仔猪组织中PXR表达水平,结果表明LPS处理显著下调肝脏和肾脏中PXR m RNA和蛋白表达,而BNPP预处理可显著缓解LPS对PXR的下调作用,结果与预期相符。为进一步研究LPS及其诱导的主要促炎细胞因子对PLE和PXR表达的下调作用,在既表达促炎细胞因子又表达PLE的原代猪肺泡巨噬细胞（Pig alveolar macrophages,PAM）中进行了试验。1μg/m L LPS处理PAM不同时间后,检测TNF-α/IL-1β及PLE/PXR的表达水平,结果显示LPS可时间依赖性诱导TNF-α/IL-1β的产生及下调PLE的m RNA和蛋白水平及PXR的m RNA水平,且PLE的下调发生在大量TNF-α产生之后。不同剂量的LPS处理PAM,12h或24h后检测TNF-α/IL-1β及PLE/PXR的表达水平,结果显示LPS呈剂量依赖性诱导TNF-α/IL-1β产生和下调PLE/PXR的表达水平,而且LPS以能诱导TNF-α/IL-1β产生的剂量才能下调PLE/PXR表达。与体内试验结果相比,以上结果同样提示LPS诱导的TNF-α/IL-1β下调PLE表达,而且LPS对PLE的下调主要是通过诱导产生的TNF-α/IL-1β实现。因此,分别用不同剂量的TNF-α（1,2,3,4ng/m L）和IL-1β（0.1,0.2ng/m L）处理PAM细胞,12h或24h后检测PLE/PXR的表达水平,结果显示TNF-α和IL-1β都可剂量依赖性下调PLE的m RNA和蛋白及PXR的m RNA表达水平,表明TNF-α和IL-1β都能抑制PLE和PXR表达。为锁定LPS及TNF-α/IL-1β抑制PLE/PXR表达所涉及的信号通路,分别用LPS及TNF-α/IL-1β的三种主要信号通路（NF-κB、p38MAPK和JNK）的抑制剂预处理PAM后,分别再用LPS/TNF-α/IL-1β处理,12h或24h后,检测LPS诱导的促炎因子TNF-α/IL-1β以及PLE/PXR的表达水平。结果显示NF-κB抑制剂BAY11-7082能完全解除LPS诱导TNF-α和IL-1β产生,其也能完全解除LPS及TNF-α/IL-1β对PLE和PXR的抑制,而其余两种抑制剂则不能解除,表明LPS及其诱导的TNF-α和IL-1β都是通过NF-κB信号通路下调PLE和PXR表达的。为验证PXR对PLE表达的调控作用,进行PXR干扰试验,沉默PAM中PXR可显著下调PLE,表明PXR可上调PLE表达。结合前述结果,表明LPS及其诱导的TNF-α/IL-1β可通过下调PXR而下调PLE。最后,研究了PLE启动子上的PXR的反应元件。根据PLE启动子存在720bp反向互补结构的特点,分段构建了p GL3-PLE-287/+66、p GL3-PLE-1000/+66、p GL3-PLE-4412/+66、p GL3-PLE-5133/+66和p GL3-PLE-7930/+66荧光报告质粒,双荧光素酶报告试验结果显示:在猪肺泡巨噬细胞系3D4/21和猪肾细胞系PK15细胞中,PXR都能显著增强不同长度PLE启动子转录活性,证明PLE启动子上存在PXR结合位点,且PXR是PLE的转录激活因子。据生物信息学预测到的PLE启动子上的8个PXR结合位点,分别构建8个位点存在和相应缺失的报告质粒,试验结果表明PXR能通过PLE启动子上的3个位点（-576/-591、-7762/-7801和-7893/-7930）增强PLE启动子转录活性;在猪肝原代细胞中采用Chip验证了PXR在PLE上的结合位点,结果显示PXR在前述3个位点有明显富集,而且LPS/TNF-α/IL-1β分别处理后,PXR在3个位点的富集都明显下降。证明PLE启动子上的PXR反应元件是-576/-591、-7762/-7801和-7893/-7930位点,PXR与之结合可上调PLE表达。本研究阐明了LPS诱导的炎症反应负调控PLE的分子机制,即LPS主要通过其诱导的TNF-α/IL-1β,激活NF-κB下调PXR而下调PLE水平,结合PLE通过水解大麻素而显著促炎的发现,全面揭示了PLE在LPS诱导的炎症反应中的分子作用机制,表明下调PLE表达或抑制其活性可作为治疗过度炎症反应的一种安全策略,而增加PLE表达亦可促进炎症反应。本研究结果可为猪炎症相关疾病防控打开新视野,开发猪新型抗炎药物提供靶标。