研究背景:类风湿性关节炎(RA)是一种常见的慢性炎症性自身免疫性疾病,其特征是持续的滑膜炎及全身炎症,多侵犯关节,以多发性和对称性慢性滑膜炎为特征,常常会导致关节破坏、功能障碍,甚至死亡。然而,RA的发病机制仍不明确,目前仍无法从根本上治愈这种疾病。RNA干扰(RNAi)是一种基因表达调控的重要机制,其过程主要是由小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(microRNA)来完成的。最近研究发现:一些异常表达的微小RNA参与了类风湿性关节炎发病机制,并有可能成为类风湿性关节炎诊断和治疗的潜在生物靶点。例如:miR-24、miR-26a、miR-125-5p和miR-323-3p在类风湿性关节炎中表达异常升高,表明这些微小RNA可能成为类风湿性关节炎的生物标志物。miR-146a在类风湿性关节炎中显著升高,并和TNF-α水平及疾病活动度相关。miR-19可以调节类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞TLR2基因的表达。此外,目前已有关于类风湿性关节炎微小RNA的相关体内治疗试验研究。因此,微小RNA将有可能成为治疗类风湿性关节炎的新的治疗策略。Drosha、Dicer和RNA诱导沉默复合物(RISC)是参与RNA干扰机制的关键酶。而在哺乳动物中RISC引起基因沉默或降解的过程中,Ago2是关键的酶。陈兰芳等发现在系统性红斑狼疮患者中,Dicer、Ago2的表达水平明显升高,并且Dicer的升高提示系统性红斑狼疮的活动及肾脏损伤。在类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮患者中,Dicer和Ago2可以被抗-Su抗体所识别,提示Dicer和Ago2可能参与了类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮的发病。但是目前还没有Dicer、Ago2、Drosha与类风湿性关节炎的相关性报道。研究这些RNA干扰中的关键酶与类风湿关节炎的相关性,并对其功能研究,有助于发现新的类风湿关节炎易感基因和新的药物靶点,有助于更好的理解类风湿关节炎的发病机制。研究目的:本研究旨在检测类风湿关节炎患者外周血白细胞中参与RNA干扰机制的关键酶Dicer、Ago2、Drosha的表达,并分析其与类风湿关节炎患者临床特征的相关性。在此基础上探索差异性表达的RNAi关键酶在RA发病中的作用。同时阐述了 RNAi关键酶Dicer对细胞因子的作用,特别是对TNF-α表达的影响,为发展新的疾病治疗干预的靶点和手段打下基础。材料与方法:1.第一部分实验,Dicer、Ago2、Drosha在类风湿关节炎中的表达1.1临床资料:50例RA患者来自淄博市中心医院住院或门诊病人,25例健康对照来自淄博中心医院健康体检人员。其中RA病人女性38例,男性12例,年龄28-85岁,平均病程54个月。健康对照25例,女性19例,男性6例,年龄31-78岁,无相关疾病及近期感染。RA患者符合1987年ACR分类标准。本研究经淄博市中心医院伦理委员会批准,采血时获得患者的知情同意。1.2 RNA抽提和逆转录:收集外周血,白细胞通过草酸胺法裂解外周全血红细胞获得,将取得的白细胞加入1mlTrizol,保存于-80℃冰箱备用。用Trizol法将收集的外周血白细胞抽提出总RNA,其RNA浓度用紫外分光光度计测定。将RNA用oligo dT、Primescript RT Reagent kit(TaKaRa 公司)逆转录为 cDNA。1.3引物设计:由上海生工公司合成扩增引物,设定内参基因为RPL13a。引物序列如下:RPL13a 上游引物 5’-CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA-3’,下游引物 5’-TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA-3’;Dicer 上游引物 5 ’-AGGAAGAGGCTGACTATGAAG-3’,下游引物 5’-GGTTGAAAAAGGAGAAAGAGA-3’;Ago2 上游引物5,-GTCTCTGAAGGCCAGTTCCA-3’,下游引物 5’-ATACAGGCCTCACGGATGG-3 ’;Drosha 上游引物 5 ’-CAGCTACGAACGGAGCAGT-3’,下游引物 5’-TTTTTCTTCCTCCCAACGAG-3’。1.4实时荧光定量聚合酶链反应:实时荧光定量反应在ABIPrism7900仪器上操作进行。SYBRGreen实时荧光定量PCR反应条件为:95℃×15s(95℃×5s60℃×30s)×40个循环,95℃×15s60℃×15s95℃×15s。以SDS2.3软件分析CT值。计算出标化后的-△△1CT值。2.第二部分实验Dicer对类风湿关节炎相关细胞因子的影响2.1细胞培养:Hela、THP-1、MT2细胞购自于中国科学院上海生命科学院细胞所,来源于ATCC(美国菌种保藏中心),Hela细胞用含100U/ml青霉素-链霉素以及DMEM培养液加10%胎牛血清培养,在含5%CO237℃的细胞培养箱中孵育。THP-1、MT2细胞用含100U/ml青霉素-链霉素以及RPMI 1640培养液加10%胎牛血清培养,在含5%C0237℃的细胞培养箱中孵育。分离的外周全血单个核细胞用RPMI 1640加10%健康人或类风湿关节炎患者血清培养以及100U/ml青霉素-链霉素培养,在37℃含5%CO2的细胞培养箱中孵育。2.2细胞转染:在Hela、THP-1、MT2细胞中转染Dicer的小干扰RNA(siRNA)及相关对照,转染48h后加入1Ong/mL的LPS刺激2h。Dicer小干扰RNA:正义链55-ACUGCUUG AAGC AGCUCUGG AdTdT-3’,反义链 5’-UCCAGAGCUGCUUCAAGCAGUdTdT-3’;小干扰 RNA 对照:正义链5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAdTdT-3’,反 义链 5’-TTGTACTACACAAAAGTACTG dTdT-3’。2.3 ELISA检测TNF-α、IL-10、IL-6的表达:用ELISA方法检测Dicer的小干扰RNA对TNF-α、IL-10、IL-6的蛋白表达水平的影响。检测过程严格按照TNF-α、IL-10、IL-6 ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)操作步骤进行。2.4外周全血单个核细胞分离:通过密度梯度离心法获得外周全血单个核细胞。所有样本来自健康志愿捐献者。2.5 RNA抽提和逆转录:收集刺激后的外周血单个核细胞,加入1ml Trizol,保存于-80℃冰箱备用。用Trizol法将外周血单个核细胞抽提出总RNA,其RNA浓度用紫外分光光度计测定。将RNA用 oligo dT、Primescript RT Reagent kit(TaKaRa公司)逆转录为cDNA。2.6引物设计:由上海生工公司合成扩增引物,设定内参基因为RPL13a。引物序列如下:RPL13a 正义链 5 ’-CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA-3’,反义链 5 ’-TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA-3 ’;Dicer 正义链 5 ’-AGGAAGAGGCTGACTATGAAG-3’,反义链 5’-GGTTGAAAAAGGAGAAAGAGA-3’;TNF-α 正义链 5’-CCCAGGGACCTCTCTCTAATCA-3’,反义链 5’-GCTACAGGCTTGTCACTCGG-3’;IL-10 正义链5 ’-AAAAGAAGGCATGCACAGCTCAG-3’,反义链 5’-GTGGGTGCAGCTGTTCTCAGACT-3’。2.7实时荧光定量PCR:用实时荧光定量PCR的方法检测外周全血单个核细胞刺激后Dicer、TNF-α、IL-10mRNA的水平变化。在ABIPrism7900上进行实时荧光定量PCR操作。SYBRGreen实时荧光定量PCR反应条件为:95℃×15s(95℃×5s60℃×30s)×40个循环,95℃×15s60℃×15s95℃×15s。以SDS2.3软件分析CT值。计算出标化后的-△△CT值。3.第三部分实验调节Dicer表达的微小RNA对细胞因子TNF-α的影响3.1.双荧光报告检测首先扩增出含有let-7/miR-98结合位点的Dicer mRNA 3’UTR片段,然后将此克隆片段连接到psiCHECKTM-2载体中。设计Dicer 3’UTR片段的PCR扩增引物(正义链:5’ CCG CTC GAG GCT CAT TAT TTC CAT CTT T 3,,反义链:5,TAG CGG CCG CAC CAC ATT TTT TTC CTC TC 3’)对Dicer基因进行PCR反应,扩增出一大小为1708bp大小的DNA片段。经过限制性内切酶(not1和xho1)切割后,插入到psiCHECKTM-2载体中。将let-7/miR-98模拟物/阻遏物及相关对照和Dicer基因mRNA 3’UTR载体共同转染于Hela细胞,转染24小时后,通过CENTRO XS3LB 960仪器进行检测,详细操作步骤请参阅仪器产品说明书。3.2细胞转染:第一天将2×105个Hela细胞均匀平铺于24孔板中。第二天应用转染试剂Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen公司)转染miR-98模拟物/抑制物及其对照,终浓度为100nM。3.3 RNA抽提和逆转录:收集Hela细胞,加入1ml Trizol并保存于-80℃冰箱备用。用Trizol法将收集的Hela细胞抽提出总RNA,其RNA浓度用紫外分光光度计测定。将RNA 用 oligodT、PrimescriptRTReagentkit(TaKaRa 公司)逆转录为 cDNA。3.4实时荧光定量PCR检测:转染miR-98模拟物/抑制物后对Dicer mRNA表达的影响:在ABI Prism7900上进行实时荧光定量PCR操作。SYBR Green实时荧光定量PCR反应条件为:95 ℃ × 15s(95 ℃ ×5s 60℃ ×30s)×40个循环,95 ℃ × 15s 60℃ × 15s 95 ℃ × 15s。以SDS2.3软件分析CT值。计算出标化后的-△△CT值。3.5 Western Blot检测:转染miR-98模拟物/抑制物后通过Western Blot检测其对Dicer的蛋白表达的影响。将Hela细胞接种在六孔板中,转染100nM的miR-98模拟物/抑制物。转染24小时后,裂解细胞,提取蛋白质。将上清液进行SDS-PAGE电泳,用指示的抗体印迹,并用化学发光法检测。Dicer和β-actin抗体购自Abcam和Chemicon公司。HRP结合的二抗购自Santa Cruz公司。使用Quantity One 4.52(Bio-Rad)分析蛋白相对含量。3.6ELISA检测TNF-α表达:转染转染miR-98模拟物/抑制物及其对照,转染48h后加入10ng/mL的脂多糖刺激2h,收集上清液。用ELISA法检测TNF-α蛋白的表达水平。检测过程严格按照TNF-α ELISA检测试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)操作步骤进行。统计分析用GraphPad Srism 5软件对样本数据进行分析,比较分析采用的是非配对t检验,相关性分析采用的是Spearman检验。P值<0.05表示有显著统计学意义。结果:1.第一部分实验结果Dicer和Drosha表达水平在RA患者中较健康对照组显著升高(p<0.0001,p =0.0235)。Dicer表达水平与RA患者C反应蛋白水平、血沉正相关(r=0.4813,p=0.0004;r=0.4028,p=0.0037)。中高度活动组 RA 患者 Dicer、Drosha 表达显著高于低度以下活动组(p=0.0107,p=0.0246)。进一步相关性分析显示,Dicer和DAS28评分显著正相关(r=0.4893,p=0.003)。2.第二部分实验结果转染Dicer的小干扰RNA降低Dicer表达后,可以增加TNF-α的表达,降低IL-10的表达,但对IL-6的表达无明显影响。LPS刺激后,Dicer及TNF-α mRNA表达水平升高(0-4小时),他们的表达水平在刺激4小时时达到高峰,且他们的变化趋势相同。用类风湿关节炎病人的血清(终浓度为10%)培养健康人外周血白细胞,可以模拟出与LPS刺激相似的TNF-α和Dicer mRNA波动趋势。3.第三部分实验结果Let-7/miR-98家族可以直接作用于Dicer 3’UTR,调节Dicer基因的表达。转染miR-98的模拟物(降低Dicer的表达)可以增加TNF-α的蛋白表达,转染miR-98的阻遏物(升高Dicer的表达)可以降低TNF-α的蛋白表达。结论:Dicer mRNA在RA患者中表达升高。Dicer表达与疾病的活动度相关,可以作为RA活动性指标。Dicer参与了 LPS诱导TNF-α产生的过程,并对TNF-α的表达有调控作用。RA患者的血清可以激活Dicer和TNF-α表达,而激活的Dicer可以抑制TNF-α表达,提示Dicer对RA患者中TNF-α的产生起到重要的调控作用。另一方面,Dicer可以促进IL-10的表达进而抑制了炎症反应的扩大。因此Dicer在平衡炎症细胞因子产生的过程中发挥了重要作用,从而避免了炎症反应的进一步扩大及系统损伤。同时本研究找到了可以间接调控TNF-α表达的miRNA,即:let-7/miR-98家族,这为发展新的以TNF-α为治疗靶点的小分子制剂打下了基础。