【摘 要】
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【目的】C1GALT1在多种恶性肿瘤中呈现异常表达。课题组前期研究发现C1GALT1基因参与胃癌细胞生物学行为进展。本研究旨在探究C1GALT1基因在胃癌细胞增殖、迁移和侵袭中所涉及的分子机制。【方法】1.使用GSCA、TCGA数据库分析C1GALT1在胃癌中表达情况。通过Western Blot加以验证。2.使用Starbase、Target Scan数据库预测可与C1GALT1相互作用的miR
【基金项目】
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湖南省自然科学基金（课题编号:2019JJ80022）；
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【目的】C1GALT1在多种恶性肿瘤中呈现异常表达。课题组前期研究发现C1GALT1基因参与胃癌细胞生物学行为进展。本研究旨在探究C1GALT1基因在胃癌细胞增殖、迁移和侵袭中所涉及的分子机制。【方法】1.使用GSCA、TCGA数据库分析C1GALT1在胃癌中表达情况。通过Western Blot加以验证。2.使用Starbase、Target Scan数据库预测可与C1GALT1相互作用的miRNA。双荧光素酶报告基因实验检测miR-199b-5p与C1GALT1的结合情况。3.Western Blot检测C1GALT1在胃癌细胞MGC-803、BGC-823以及永生化胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达情况。q RT-PCR检测miR-199b-5p在同样细胞系中的表达情况。4.运用脂质体转染法将miR-199b-5p mimics、miR-199b-5p inhibitor、C1GALT1干扰载体Si-C1GALT1及与对应的阴性对照mimics-NC、inhibitor-NC、Si-NC等分别瞬时转染胃癌BGC-823细胞。构建Si-C1GALT1与miR-199b-5p inhibitor共转染的BGC-823细胞系。通过Western Blot检测转染效率。5.CCK8增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验分析miR-199b-5p、Si-C1GALT1和共转染分别对BGC-823细胞恶性行为的影响,并分析两者在功能上的相关性。6.通过Western Blot检测miR-199b-5p、Si-C1GALT1以及共转染对BGC-823细胞EMT相关蛋白的影响。【结果】1.Star Base v2.09、GSCA数据库显示,与正常胃组织相比,胃癌组织中C1GALT1的表达水平较高（P＜0.05）。Western Blot证实:相较于胃黏膜上皮细胞GES-1,C1GALT1在两种胃癌细胞系中表达均升高（P＜0.05）。2.Starbase、Target Scan数据库发现C1GALT1基因3′端存在miR-199b-5p的结合位点。双荧光素酶报告基因实验显示C1GALT1与miR-199b-5p之间存在结合作用。3.RT-q PCR呈现为:miR-199b-5p在两种胃癌细胞系表达较GES-1低表达（P＜0.01）。4.Western Blot呈现为:miR-199b-5p mimics使C1GALT1蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）;相反,miR-199b-5p inhibitor使C1GALT1蛋白表达水平升高（P＜0.05）。转染Si-C1GALT1后,C1GALT1表达下调（P＜0.01）。Si-C1GALT1与miR-199b-5p inhibitor的共转染中C1GALT1的表达较Si组升高,但低于Si-NC组（P＜0.05）。这表明miR-199b-5p对C1GALT1具有负向调控作用。5.CCK8增殖实验、划痕实验、迁移、侵袭实验结果呈现为miR-199b-5p mimics组细胞增殖、迁移、侵袭能力下降;相反,miR-199b-5p inhibitor组细胞增殖、迁移、侵袭能力增强（P＜0.01）。Si-C1GALT1组细胞增殖、迁移、侵袭能力下降（P＜0.01）。将Si-C1GALT1与miR-199b-5p inhibitor共转染BGC-823细胞,其增殖、迁移、侵袭能力较Si组显著升高,但低于Si-NC组（P＜0.01）。6.EMT结果显示,miR-199b-5p mimics组E-cadherin和Claudin-1呈现高表达,而Vimentin、Slug呈现低表达（P＜0.05）;相反,miR-199b-5p inhibitor组E-cadherin和Claudin-1呈现低表达,而Vimentin、Slug呈现高表达（P＜0.05）。Si-C1GALT1组E-cadherin和Claudin-1呈现高表达,而Vimentin、Slug呈现低表达（P＜0.05）。将Si-C1GALT1与miR-199b-5p inhibitor共转染BGC-823细胞,共转染组E-cadherin和Claudin-1表达较Si-C1GALT1减少,而Vimentin、Slug表达较Si-C1GALT1组增加（P＜0.05）。【结论】Mi R-199b-5p靶向调控C1GALT1基因表达,从而参与胃癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为,其部分分子机制可能与EMT相关蛋白表达改变有关。
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