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研究背景:三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）是一种缺乏雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）和人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2,HER2）的乳腺癌（Breast cancer,BC）亚型,占所有BC发病率的15-18%。TNBC具有发病年龄小、复发几率高、耐药出现的早、更易出现转移等特点,被认为是最具侵袭性和异质性的BC亚型,此外,TNBC缺乏特异性生物标志物和靶基因,这导致缺乏有效的治疗策略。细胞周期蛋白依赖激酶4和6（Cyclin-dependent kinases 4 and 6,CDK4/6）是细胞周期的基本驱动因素,它与BC的发生发展密切相关。目前,细胞周期蛋白依赖性激酶4和6抑制剂（Cyclin-dependent kinases 4 and 6 inhibitors,CDK4/6i）治疗BC很大程度上归因于它们能够通过抑制CDK4/6介导的视网膜母细胞瘤基因（Retinoblastoma,Rb）磷酸化水平,选择性地将肿瘤细胞阻滞在细胞周期的G1期,特别是对于激素受体（Hormone receptor-positive,HR）阳性、人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2,HER2）阴性的转移性乳腺癌（Metastatic breast cancer,MBC）患者效果显著。令人欣喜的是,研究发现TNBC细胞的增殖依赖于CDK4/6,CDK4/6i通过调节Rb蛋白发挥抑制细胞从G1到S期的作用。然而,TNBC细胞有含量非常高的溶酶体隔离了CDK4/6i,所以药物难以递送到细胞周期蛋白-CDK复合体发挥抑制作用,这是目前亟待解决的问题。聚氨基酸纳米材料递送体系有助于溶酶体逃逸的发生,基于这一特点,我们希望通过聚氨基酸纳米材料实现CDK4/6i溶酶体逃逸,使TNBC恢复对药物的敏感性。此外,CDK4/6i纳米药物（CDK4/6i NGs）将发挥纳米药物在体内的生物学行为优势,如提高生物利用度、促进肿瘤的被动靶向性、延长血液半衰期、显著提高肿瘤抑制效果等。CDK4/6i不仅能阻滞细胞周期,还能调节肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）引起有效的抗肿瘤免疫。CDK4/6i具有减少调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）的数量,同时增强效应T细胞的功能,重塑TNBC免疫微环境,从而达到强而持久的免疫治疗效果。TNBC患者免疫应答不良可能与程序性死亡-配体1（Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1）表达相对较低、新抗原载量较低以及相应的肿瘤抗原反应性不足等机制有关。CDK4/6i还可以通过增加PD-L1免疫检查点阻断的疗效来增强抗肿瘤免疫。聚氨基酸纳米材料递送CDK4/6i治疗TNBC的策略,一方面通过调控细胞周期来抑制肿瘤的增殖,另一方面通过重塑免疫微环境来增强免疫应答,发挥抗肿瘤的作用。本研究中我们通过调节不同链长的聚乙二醇(（poly（ethylene glycol）,PEG）构建具有pH及谷胱甘肽（glutathione,GSH）双响应性聚乙二醇单甲醚-聚（谷氨酸-co-胱氨酸）[methoxy poly（ethylene glycol）-poly（L-glutamic acid-co-L-cystine）,m PEGn-P(Glu10-co-Cys5~2)]纳米载体递送CDK4/6i,克服了小分子药物在溶酶体中逃逸困难的问题,重塑了免疫抑制微环境,并对CDK4/6i NGs联合ICIs治疗进行了探索。本研究为细胞周期抑制剂治疗TNBC提供了一种很有前景的策略,并有助于探索CDK4/6i治疗TNBC的更大的潜力。目的:本研究设计了pH和GSH双响应性m PEGn-P(Glu10-co-Cys5~2)载体递送CDK4/6i的纳米载体,并通过自组装的方式制备成聚氨基酸CDK4/6i NGs。探究不同链长PEG聚氨基酸纳米药物在TNBC细胞和小鼠TNBC模型中的肿瘤抑制效果及相关机制。旨在为开发高效治疗TNBC的纳米递送系统提供理论基础。方法:（1）制备聚氨基酸CDK4/6i NGs并进行表征。通过开环聚合（ring-opening polymerization,ROP）合成了m PEGn-P(Glu10-co-Cys5~2)具有pH和GSH具备双响应性的纳米载体。通过正负电的相互作用实现纳米载体与药物的稳定结合。纳米沉降法获得了递送CDK4/6i聚氨基酸纳米药物CDK4/6i NGs:NG750/ABE、NG2000/ABE、NG5000/ABE。对粒径、电势、载药率（Drug loading content,DLC）、载药效率（Drug loading efficiency,DLE）、及响应性释放等性能进行表征。（2）探究纳米递送载体在小鼠TNBC细胞中溶酶体逃逸能力及聚氨基酸CDK4/6i NGs体外的作用。流式细胞术及激光共聚焦检测小鼠TNBC细胞（4T1）对聚氨基酸纳米载体的摄取情况;共聚焦的共定位分析纳米载体的溶酶体逃逸情况;CCK-8法检测CDK4/6i NGs的细胞毒性;流式细胞术评价CDK4/6i NGs调控细胞周期和细胞凋亡;荧光倒置显微镜观察CDK4/6i NGs引起细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生;评估CDK4/6i NGs诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）的能力。（3）探究聚氨基酸CDK4/6i NGs在体内的代谢和药物分布变化,以及肿瘤抑制和调节免疫微环境的作用。建立4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型评价聚氨基酸CDK4/6i NGs对模型鼠生物学行为的影响,如药物代谢实验、活体成像实验、离体成像实验、肿瘤抑制实验、生存实验等,应用流式细胞术和酶联免疫吸附实验对CDK4/6i NGs治疗TNBC对免疫微环境的调节（免疫细胞及免疫因子）进行检测,免疫组织化学染色评价肿瘤组织中Ki-67,caspase3,cyclin D,cyclin E及p Rb相关蛋白表达水平。最后,通过体重监测、生化指标、血常规检测及鼠脏器的组织病理学分析,评估纳米制剂的生物安全性。结果:（1）核磁共振氢谱、傅立叶变换红外光谱以及元素分析证实成功构建了具备pH和GSH双响应性的递送CDK4/6i（ABE）纳米载体。构建的纳米药物NG750/ABE、NG2000/ABE及NG5000/ABE尺寸较为均一,分别为123.1±1.4 nm,89.3±1.7 nm,118.8±3.8 nm;电势分别为-10.6±1.8 m V,-15.7±1.3 m V,-12.9±0.5 m V,具有良好的稳定性。由正负电相互作用实现药物负载DLC分别为22.5%,18.5%,14.7%;DLE分别为在81.0%,79.0%,37.0%。CDK4/6i NGs在pH 5.5和含有GSH环境中具有响应性结构崩解可以定点释放ABE药物。（2）鼠源TNBC细胞（4T1）内吞CDK4/6i NGs有显著差异具有时间依赖性,Cy5.5-NG2000细胞摄取效率最高。共定位分析可以判定CDK4/6i NGs具有溶酶体逃逸能力。CDK4/6i NGs效果优于游离药,并且纳米药NG2000/ABE具有更强的细胞毒性、细胞周期抑制效果、细胞凋亡水平,诱导ICD效果最佳。（3）CDK4/6i NGs可以延长药物血液循环时间,NG2000/ABE药物半衰期是游离药的5倍。活体成像实及离体成像显示CDK4/6i NGs在TNBC肿瘤组织中被动靶向富集,NG2000荧光强度最强,持续时间最久。NG2000/ABE对4T1荷瘤小鼠肿瘤抑制效果最佳,肿瘤抑制率为82.2%,具有最佳的生存期的延长效果。NG2000/ABE与αPD-L1联合应用具有一定潜力。NG2000/ABE具有调节免疫微环境的作用,增强CD4+T和CD8+T细胞的比例,抑制了Treg细胞,提高了抗肿瘤细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2,降低了免疫耐受因子TGF-β。免疫组织化学染色在蛋白水平证实CDK4/6i NGs肿瘤抑制效果优于游离药。体重监测、生化指标、溶血实验、血常规检测及脏器的组织病理学观察明确了纳米药具有可靠的生物安全性。结论:（1）成功构建了三种递送CDK4/6i聚氨基酸纳米药物CDK4/6i NGs。（2）聚氨基酸CDK4/6i NGs具有显著抑制TNBC生长的作用。（3）聚氨基酸CDK4/6i NGs克服了小分子游离CDK4/6i在TNBC中溶酶体逃逸困难,提高TNBC对于药物的敏感性。（4）聚氨基酸CDK4/6i NGs延长了药物循环半衰期,重塑了TNBC的免疫微环境,抑制TNBC生长的作用显著。