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背景及目的 肠上皮屏障（intestinal epithelial barrier，IEB）是机体防御的重要屏障，承担着维持内环境稳态、抵御病原入侵等关键性任务，其结构基础包括完整的肠粘膜上皮细胞(Intestinal epithelial cell，IEC)以及上皮细胞间的紧密连接蛋白(Tight junction，TJ)。众多研究表明，IEB既在战创伤、烧伤、大型手术等外科应激下充当反应的中心器官，也加速了全胃肠外营养(Total parenteral nutrition，TPN)、炎性肠病(Inflammatory boweldisease，IBD)等慢性病理刺激下疾病的发展进程，IEB损伤造成的肠道细菌移位，继而引发的肠源性感染，是导致多脏器功能衰竭(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)及全身炎性反应综合症的重要原因。肠屏障功能的调控与肠粘膜的氧浓度密切相关，多种急慢性病理条件下都会伴有肠道的局部缺氧，引起大量炎症因子的释放及紧密连接蛋白的破坏，从而加剧肠粘膜屏障IEB功能损伤。 白细胞介素22(Interleukin-22，IL-22)是近年来发现的一种新型细胞因子，由多种免疫细胞分泌，只特定作用于少数组织器官如皮肤、消化道、肾脏等非造血细胞。IL-22具有双重生物学作用:防御保护或促炎致病，这主要取决于其所处的炎症微环境不同。IL-22作为一种保护因子，与表达于肠上皮细胞IEC的受体复合物IL-22RAl/IL-10RB2结合后，发挥了抗炎、分泌抗菌肽、重塑杯状细胞及促进组织修复等功能。 大量研究发现，在以肠上皮通透性增高及慢性炎症为主要特征的炎症性肠病的发生发展中，IL-22起到了至关重要的作用:在Th1及Th2细胞介导的结肠炎中，IL-22可以缓解炎症，增强IEB功能。IL-22也可以缓解人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus，HIV)感染所引起IEB功能下降。IL-22不仅在肠粘膜的损伤保护中起到了至关重要的作用，在其他脏器缺血再灌注(Ischemia and reperfusion，I/R)损伤中也起到了重要的保护作用。Chestovich PJ等利用小鼠肝脏的I/R损伤模型，首次证实了重组IL-22可以明显减轻肝脏I/R损伤，并且推断该作用可能依赖于STAT3信号通路。 IL-22在肠道的损伤修复中发挥重要作用，但是目前尚无关于IL-22能否在急性缺氧条件下减轻肠屏障功能受损的报道。因此本课题拟通过构建动物I/R模型及肠上皮细胞缺氧模型，应用PCR、蛋白印迹、跨上皮电阻测定等技术，研究IL-22对肠屏障功能的保护作用，并初步探讨其可能的作用机制，进而为肠上皮屏障IEB功能损伤的修复机制提供新的理论依据。 研究方法 1.建立肠上皮细胞系T84缺氧模型及C57BL/6J小鼠肠道I/R模型，提取RNA及组织蛋白，通过RT-PCR及蛋白印迹技术(Western blot，WB)分别检测细胞因子IL-22及其受体IL-22RA1、TJ分子Occludin的mRNA水平及蛋白水平的变化情况。 2.建立肠上皮细胞系T84缺氧模型及rIL-22干预模型，通过Transwell小室细胞培养进行跨上皮电阻(Transepithelial resistance，TER)测定技术检测肠粘膜屏障通透性，了解缺氧及rIL-22干预情况下肠上皮细胞TER的变化情况，以了解IL-22对于肠上皮屏障功能的影响。 3.应用上述细胞模型，通过RT-PCR、蛋白印迹(Western blot，WB)技术，检测rIL-22对缺氧条件下肠上皮细胞系T84的TJ分子:Claudin-1、Claudin-4、Occludin及ZO-1的mRNA及蛋白水平变化影响，并用免疫荧光技术检测ZO-1及Occludin在缺氧前加入rIL-22预处理后的表达变化。 4.在上述细胞模型中，通过蛋白印迹WB技术分别检测p(Tyr701)-STAT1、p(Ser727)-STAT1、STAT1、PI3K及加入STAT1磷酸化阻断剂AG490后STAT1的磷酸化水平及Occludin在各实验组的表达变化，探讨IL-22对缺氧条件下肠上皮屏障调节可能的作用机制及信号通路。 研究结果 1.I/R条件下肠上皮IEC的IL-22表达升高，而IL-22RA1的表达明显减低;2％氧浓度缺氧致使T84细胞的IL-22RA1的mRNA及蛋白表达水平降低，并且在缺氧6h时最为明显(P＜0.05），该降低经予以100 ng/ml的rIL-22预处理并未得到明显改善(P＞0.05)。 2.缺氧引起了肠上皮IEC细胞TER水平降低，该降低经给予rIL-22预处理后可明显得到改善(P＜0.001)。 3.单纯2％氧浓度缺氧处理会使紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1及Claudin-4的mRNA及蛋白表达水平较常氧条件明显降低(P＜0.001），而rIL-22预处理可以减轻缺氧对上述紧密连接蛋白造成的损伤(P＜0.001)。此外，免疫荧光结果提示缺氧也会导致紧密连接蛋白分布异常，使其松散、断裂、不规则，而IL-22的干预会使得原本完整并且紧凑、连续的网格状结构得到部分恢复。 4.缺氧情况下STAT1的酪氨酸磷酸化水平显著升高，而rIL-22预处理后该磷酸化水平显著降低(P＜0.001);而STAT1的丝氨酸磷酸化及PI3K在单纯缺氧处理及缺氧前予以rIL-22预处理两组间表达无明显差异(P＞0.05）。 5.予以STAT1磷酸化阻断剂AG490处理细胞，结果显示AG490对于STAT1的酪氨酸磷酸化抑制作用强于IL-22，但该处理组紧密连接蛋白Occludin的蛋白水平却低于IL-22处理组(P＜0.05)。 结论 1.小鼠I/R损伤导致肠道粘膜的IL-22表达升高，因IL-22严格由免疫细胞分泌，故在肠上皮细胞系中未发现其表达;小鼠I/R损伤及T84细胞缺氧条件IL-22RA1表达明显下降，说明IL-22有可能通过与其受体结合的方式，参与了缺氧对肠上皮屏障损伤的调控。 2.IL-22有效减轻了缺氧所致的肠上皮屏障损伤。IL-22预处理可以明显改善急性缺氧损伤所导致的紧密连接蛋白表达及分布异常。同时，IL-22也明显缓解了急性缺氧所致TER水平的下降，说明IL-22能够有效减轻急性缺氧损伤对肠上皮屏障功能的破坏。 3.IL-22通过抑制STAT1的酪氨酸磷酸化水平发挥其保护作用。IL-22处理可以显著地抑制STAT1酪氨酸磷酸化水平，而STAT1磷酸化阻断剂AG490对STAT1酪氨酸磷酸化的抑制作用强于IL-22，但该处理组的Occludin蛋白水平却低于IL-22干预组，说明IL-22通过抑制STAT1酪氨酸磷酸化信号通路维持紧密连接蛋白的表达，但同时还存有其他信号通路协同作用，共同参与了IL-22在缺氧条件下对肠上皮屏障的调控与保护。