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研究背景结直肠癌（CRC）是全世界每年超过70万病人死亡的第三大癌症相关死亡原因。非转移性结直肠癌患者整体预后较好,5年生存率可高达90%,但晚期转移性结肠癌患者预后不佳,5年生存率为65%。因此,探索晚期结直肠癌治疗的新靶点是非常重要的。β-Arrestin 蛋白包含β-Arrestin 1（ARRB1）和 β-arrestin 2（ARRB2）,它们广泛表达在全身各组织中,主要作用于G蛋白偶联受体（GPCRs）下游,是众所周知的GPCR信号负调控因子。因此,β-Arrestin蛋白参与调节细胞基本功能的多个生理过程,包括细胞的生长和迁移。已有文献报道,ARRB2通过调节Wnt信号促进髓系白血病的发生和发展,并诱导肿瘤细胞增殖和转移。多项研究表明,肿瘤组织中表达高水平的ARRB2可能对肿瘤细胞的增殖和侵袭有调节作用。但在不同的肿瘤组织中,ARRB2可能起着截然不同的作用,有研究报道在肝癌肿瘤组织ARRB2的表达下调促进了肿瘤的侵袭。Masannat研究表明,与正常组织相比,结肠癌（CRC）肿瘤中ARRB2表达增加,而且ARRB2的高表达与患者生存期呈负相关,但ARRB2在CRC细胞迁移和增殖中的确切作用机制尚不清楚。本课题通过结肠癌患者结肠样本、小鼠动物模型、结肠癌细胞株实验等三个层面揭示ARRB2在结肠炎相关结肠癌的作用及机制,并为ARRB2作为结肠炎相关结肠癌治疗的新靶点提供科学依据。研究内容与方法1.探索ARRB2在结肠癌组织和结肠癌细胞中的表达（1）利用TCGA数据据库分析ARRB2在正常结肠组织及结肠癌组织中的表达,并采用Kaplan-Meier生存分析方法对结直肠癌患者进行生存分析;（2）利用Western Blotting及免疫荧光检测正常结肠黏膜、结肠炎和结肠癌组织中ARRB2的表达水平;（3）利用Western Blotting及Real-time PCR检测ARRB2在结肠癌细胞株中的表达水平。2.探索ARRB2表达下调对结肠癌动物模型肿瘤进展的影响（1）采用ARRB2野生型（Wild type）WT和基因敲除型（Knockout）KO小鼠,建立AOM/DSS诱导的结肠炎相关结肠癌小鼠模型;与对照组进行研究。（2）利用小鼠结肠镜检查监测在不同分组中第4、18周的小鼠结肠大体形态学差异;（3）HE染色观察在不同分组中第4、18周的小鼠结肠黏膜组织形态学差异;（4）提取结肠黏膜蛋白,利用Western Blotting检测ARRB2敲除后对PCNA、p-STAT 3和MMP 2蛋白表达的影响。3.探索ARRB2表达下调对结肠癌细胞株的细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响（1）转染shRNA敲降结肠癌细胞株HCT116和RKO细胞的ARRB2的表达,并观察其对细胞增殖的影响;（2）采用CCK8细胞活性和细胞增殖检测ARRB2的表达经sh1和sh2两个序列敲降后ARRB2表达下调的HCT116和RKO细胞株在体外增殖的情况;（3）利用集落形成实验观察ARRB2的表达下调对HCT116和RKO细胞的集落形成的影响;（4）利用Transwell迁移实验观察ARRB2的表达下调对HCT116和RKO细胞在体外的迁移和侵袭的影响;（5）利用划痕实验分析ARRB2的表达下调对HCT116和RKO细胞株迁移能力的影响;（6）利用Western Blotting检测ARRB2的表达下调对HCT116和RKO细胞中PCNA、MMP 2和MMP 9的蛋白表达的影响。4.探索转染shRNA下调ARRB2表达的结肠癌细胞和转染抗shRNA逆转敲降效率,ARRB2表达恢复后结肠癌细胞株的细胞增殖、迁移和侵袭上的差异;（1）利用CCK8细胞增殖活性检测实验分析对照组（CTL组）、shRNA2组、shRNA-resistant组之间在体外增殖的差异;（2）利用流式细胞术观察分析CTL组、shRNA2组、shRNA-resistant组之间在细胞周期上的差异;（3）利用异种移植技术观测CTL组、shRNA2组、shRNA-resistant组成瘤的体积和重量间的差异。5.探索ARRB2表达下调后结肠癌基因表达谱的改变,并分析ARRB2与WTAP相互作用对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。（1）RNA测序分析ARRB2表达下调后的HCT116细胞在TNF-α刺激的炎症状态下,其下游基因谱的改变;（2）利用KEGG分析和筛选显示上述522组差异基因相关的主要细胞通路;（3）通过免疫共沉淀分析ARRB2和WTAP在炎症性相关肠癌中的相互作用;（4）通过转染WTAP质粒使ARRB2-sh结肠癌细胞过表达WTAP,进一步明确ARRB2对WTAP的调控作用;（5）利用IHC对实体结肠癌组织中的ARRB2和WTAP的表达进行检测,检测结果采用Pearson相关系数分析进一步阐明ARRB2和WTAP的相关性。结果1.TCGA数据分析结果显示结肠癌患者肠黏膜中ARRB2的表达明显高于正常肠黏膜中ARRB2的表达,并且ARRB2的高表达与结肠癌患者生存期呈负相关;2.在AOM/DSS诱导的ARRB2野生型（WT）和基因敲除型（KO）小鼠结肠癌成瘤模型中,WT组较KO组肿瘤发生率和肿瘤数均增加;PCNA、p-STAT 3和MMP 2在WT组的表达均高于KO组;3.HCT116和RKO细胞经shRNA敲降ARRB2表达下调后,结肠癌细胞增殖、集落形成、细胞迁移和侵袭的能力均较对照组下降,迁移和侵袭能力相关蛋白PCNA、MMP 2和MMP 9的表达水平也随之下降;4.转染shRNA-resistant序列,ARRB2表达恢复后,在细胞增殖、迁移和侵袭的能力等较shRNA组均有所恢复;5.RNA-seq测序分析发现在TNF-α刺激下结肠癌细胞HCT116,WTAP基因表达随ARRB2敲降后显著下调;RNA-seq基因测序分析发现ARRB2与WTAP存在直接结合;通过转染shRNA下调ARRB2的表达后,WTAP的表达随之下降;转染WTAP质粒使其过表达后,可改善结肠癌细胞HCT116的增殖和侵袭能力,进一步证实ARRB2对WTAP的调控作用;最后对临床结肠癌患者组织病理中ARRB2和WTAP的表达行免疫组化观察并行Pearson相关系数分析显示临床结肠癌组织中ARRB2与WTAP的表达呈正相关。结论ARRB2在结肠癌中的表达较正常结肠黏膜组织表达增加,并与结肠癌患者的生存期呈负相关。下调ARRB2表达可抑制结肠癌细胞的增殖和迁移,ARRB2通过介导的WTAP表达增加进而影响Wnt通路的表达促进结肠癌细胞增殖和迁移。抑制ARRB2的表达可能是一种抑制肿瘤生长和转移的治疗策略。