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矮牵牛(Petunia hybrida)为茄科(Solanaceae)矮牵牛属(Petunia Juss.)草本花卉,被广泛应用于园林中,同时它也是研究植物花发育遗传机理的重要模式植物之一。自上世纪九十年代以来,人们就对矮牵牛花器官发育机制展开了深入研究,并提出了花发育的ABCDE模型。其中,PMADS3是从矮牵牛中克隆出来的C功能基因,其组织原位表达固定在第三、四轮花器官上,同时具有花分生组织和花器官决定的功能,超量表达PMADS3基因会使野生型矮牵牛的花瓣上出现花药结构以及花萼心皮化,而PMADS3基因被抑制则雄蕊出现明显的瓣化。由此可见,PMADS3基因与第二、三轮花器官同源异型转换存在极大的关系,即与重瓣基因存在关系。因此,对矮牵牛PMADS3及其互作基因展开研究不仅对重瓣育种具有极其重要的意义,而且雄蕊瓣化性状还可以应用于创造不育系。为了进一步探索PMADS3在矮牵牛中调控花器官发育的具体途径,发掘出与其相互作用的相关调控因子,本实验将PMADS3全长的干涉载体转化矮牵牛,观测表型并进一步利用实时定量PCR技术分析在转基因植株中其他相关花发育基因的表达情况；同时从前期实验室筛选出的与PMADS3互作的基因中挑选5个,并采用Gateway技术构建了RNAi载体,利用农杆菌介导法转化矮牵牛,获得转基因植株并分析表型。实验主要内容及结果如下：1.PMADS3基因全长干涉载体转化矮牵牛分析表型。采用根癌农杆菌介导法将PMADS3干涉载体转化矮牵牛并利用PCR技术检测转基因植株。在获得的阳性植株中,有67%的植株表现出雄蕊不同程度的瓣化,同时子房增大,但空瘪、内陷明显,花柱短小,柱头顶端闭合,后期全部无法结实。2、转基因矮牵牛中其他相关基因的实时定量PCR分析。以GAPDH为内参基因,前期课题组筛选出的与单重瓣相关的表达基因为目的基因,实时定量PCR检测其在转基因植株中的表达水平。结果表明,在转干涉载体Phellsgate2-PMADS3的强表型植株和未转化对照植株之间,表达量差异显著的转录因子主要有FBP6,FBP7,PMADS3, PMADS4,PMADS9,PMADS15.其中,在转基因植株中下调表达的基因有FBP6,FBP7, PMADS3,PMADS4,PMADS9,上调表达的基因为PMADS15。目标基因PMADS3在转化植株中相对表达量仅为0.09,表现为极显著的下调表达。3、利用Gateway技术构建矮牵牛中与PMADS3互作的5个基因的RNAi载体。提取矮牵牛RNA,RT-PCR获得其cDNA,然后PCR扩增含有attB接头的目的基因,将attB-PCR产物与Phellsgate2表达载体在BP酶作用下进行重组反应获得RNAi载体Phellsgate2-AD23、Phellsgate2-AD30、Phellsgate2-AD35、Phellsgate2-AD63和Phellsgate2-AD66。4、矮牵牛PMADS3的互作候选基因转化矮牵牛。采用根癌农杆菌介导法将AD23、AD30、AD35、AD63、AD66共5个互作基因的干涉载体转化矮牵牛并利用PCR技术检测转基因植株,最终分别获得阳性植株25株、20株、23株、23株和27株。在获得的AD63转基因植株部分株系中,T0代在营养期叶片皱缩反卷,叶片变厚,整株呈莲座状,顶端分生组织消失；花期雄蕊弱瓣化,子房增大,略显皱缩,不饱满,后期仍然能够正常结实,但TO代种子活性降低。T1代植株开花期雄蕊瓣化现象得到了明显的加强,表现为雄蕊瓣化的强表型,花药顶端衍生出明显的花瓣状结构。其它四个基因转化的矮牵牛未得到明显表型。