目的近年来,肥胖的流行率在世界范围内急剧上升。临床发现肥胖孕妇出现不良妊娠结局的风险较高,且可通过影响卵巢功能损伤女性生育能力。随着肥胖的发病率逐年增加,研究肥胖所致的卵巢功能不全具有重要意义。妊娠早期,卵巢黄体主要发挥分泌激素的功能,这一功能是维持妊娠的重要基础。肥胖是否影响了妊娠早期卵巢功能,值得进一步研究。目前,从妊娠早期探讨肥胖对卵巢黄体功能影响的研究尚少。此外,妊娠黄体形成,细胞增殖分化,需要大量能量,糖代谢与脂代谢是否参与肥胖对妊娠早期卵巢黄体功能的影响,尚不清楚。因此,本论文旨在研究高脂饮食（High-fat diet,HFD）诱导的肥胖对妊娠早期卵巢功能的影响,并从糖代谢和脂代谢的角度探讨肥胖对妊娠早期卵巢影响的可能机制。方法一、体内动物实验研究HFD对妊娠早期小鼠卵巢功能的影响及可能机制:1.动物模型建立及样本收集:C57BL/6J雌性小鼠对照组给予对照饲料喂养,HFD组给予高脂饲料喂养。饲养12周后,与同品系普通饲料饲喂的性成熟雄性小鼠于下午18点合笼,次日清晨查见阴栓记为孕第一天（D1）,于孕第七天（D7）取得两侧卵巢。建立动物模型后,进行以下检测:（1）小鼠每周称重,获取12周小鼠体重变化曲线。（2）检测小鼠葡萄糖耐量（Glucose tolerance test,GTT）,并于D7天检测小鼠血清中甘油三酯（Triglyceride,TG）和总胆固醇（Total cholesterol,TC）水平。2.HFD对妊娠早期小鼠卵巢功能的影响:（1）H&E染色方法观察小鼠妊娠早期卵巢形态,计数黄体数量。（2）ELISA方法检测小鼠妊娠早期血清雌二醇（Estradiol,E2）和孕酮（Progesterone,P4）水平。（3）免疫印迹和免疫组化方法检测类固醇激素合成相关蛋白CYP19A1、CYP11A1、StAR在小鼠妊娠早期卵巢中的表达。3.糖代谢是否参与HFD小鼠妊娠早期卵巢功能异常的机制研究:（1）RT-qPCR方法检测糖代谢通路相关基因Slc2a1、Slc2a4、Hk2、Pfkl、Pgk1、Pkm2、Ldha、Pdha1和Pdk1在小鼠妊娠早期卵巢的表达。（2）免疫印迹和免疫组织化学方法检测缺氧诱导因子HIF1-α的蛋白表达和定位,观察小鼠妊娠早期卵巢是否发生缺氧。（3）免疫印迹和免疫组织化学方法检测糖酵解氧化途径相关蛋白PDP1、PDK1、PDHA1的表达,观察小鼠妊娠早期卵巢有氧氧化途径是否发生了改变。（4）化学比色法检测小鼠妊娠早期卵巢乳酸水平,观察糖酵解是否发生了改变。4.脂代谢是否参与HFD小鼠妊娠早期卵巢功能异常的机制研究:（1）GPO-PAP酶法检测小鼠妊娠早期卵巢TG含量;油红O染色和透射电镜方法观察小鼠妊娠早期卵巢脂滴沉积情况。（2）RT-qPCR方法检测脂代谢通路相关基因Acsl4、Elovl5、Cd36、Slc27a4、Hadha和Cpt1a在小鼠妊娠早期卵巢的表达,观察脂代谢途径是否发生了改变。（3）免疫印迹方法检测小鼠妊娠早期卵巢CPT1A的表达,观察小鼠妊娠早期卵巢脂肪酸β-氧化是否发生改变。（4）化学发光法检测小鼠妊娠早期卵巢ATP水平,观察小鼠妊娠早期卵巢能量水平是否发生了改变。（5）RT-qPCR方法检测三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle,TCA）通路相关基因Cs、Idh2、Suclg1、Sdh2、Mdh2、Ndufb6、Cox10和Atp5b在小鼠妊娠早期卵巢的表达,观察TCA循环途径是否发生了改变。二、体外细胞实验研究HFD对妊娠早期小鼠卵巢功能的影响及可能机制:1.细胞模型建立:利用油酸（Oleate acid,OA）和棕榈酸（Palmitic acid,PA）培养人卵巢颗粒细胞系（Human granulosa-like tumor cell line,KGN）建立高脂细胞模型,并运用人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin,hCG）体外诱导颗粒细胞黄体化,模拟体内实验。2.OA+PA干预对黄体化的KGN细胞功能的影响:（1）CCK-8方法检测OA+PA干预对黄体化的KGN细胞活力的影响。（2）ELISA方法检测黄体化的KGN细胞上清中E2和P4水平。（3）免疫印迹方法检测类固醇激素合成相关蛋白CYP19A1、CYP11A1、St AR在黄体化的KGN细胞中的表达。3.糖代谢是否参与黄体化的KGN细胞功能异常的机制研究:（1）RT-qPCR方法检测糖代谢通路相关基因SLC2A1、PFK2、PGK1、LDHA和PDHA1在黄体化的KGN细胞中的表达。（2）免疫印迹方法检测缺氧诱导因子HIF1-α的蛋白表达,观察OA+PA干预是否导致黄体化的KGN细胞发生缺氧。（3）免疫印迹法检测糖酵解氧化途径相关蛋白PDP1、PDK1、PDHA1的表达,观察OA+PA干预是否导致黄体化的KGN细胞有氧氧化途径发生了改变。（4）化学比色法检测黄体化的KGN细胞上清乳酸水平,观察糖酵解是否发生了改变。4.脂代谢是否参与黄体化的KGN细胞功能异常的机制研究:（1）GPO-PAP酶法检测黄体化的KGN细胞TG含量;油红O染色方法观察黄体化的KGN细胞脂滴分布。（2）RT-qPCR方法检测脂代谢通路相关基因ACSL4、ELOVL5、CD36、SLC27A4、HADHA和CPT1A在黄体化的KGN细胞的表达,观察体外模型脂代谢途径是否发生了改变。（3）免疫印迹方法检测黄体化的KGN细胞CPT1A的表达,观察脂肪酸β-氧化是否发生改变。（4）化学发光法检测黄体化的KGN细胞ATP水平,观察能量水平是否发生了改变。5.采用CPT1A的特异性抑制剂乙莫克舍（Etomoxir）抑制KGN细胞脂肪酸β-氧化,观察脂肪酸β-氧化是否参与OA+PA干预并诱导黄体化的KGN细胞的功能紊乱。（1）CCK-8方法检测不同浓度乙莫克舍对OA+PA干预并用h CG诱导黄体化的KGN细胞活力的影响;免疫印迹方法检测不同浓度乙莫克舍对CPT1A的抑制效果。（2）油红O染色和透射电镜方法检测乙莫克舍干预对OA+PA培养并用h CG诱导黄体化的KGN细胞脂滴分布的影响。（3）RT-qPCR方法检测TCA循环通路和电子传递链相关基因CS、IDH2、SUCLG1、SDH2、MDH2、NDUFB6、COX10和ATP5B在黄体化的KGN细胞的表达,观察在抑制脂肪酸β-氧化后,TCA循环途径是否发生了逆转。（4）化学发光法检测黄体化的KGN细胞ATP水平,观察抑制脂肪酸β-氧化后,ATP水平是否恢复正常。（5）ELISA方法检测黄体化的KGN细胞上清E2和P4水平,观察抑制脂肪酸β-氧化后,E2和P4水平是否恢复正常。结果1.与对照组相比,HFD组小鼠高脂喂养12周后,体重明显增加;葡萄糖耐量发生异常;D7天血清TG和TC水平也显著升高。2.与对照组相比,HFD组小鼠D7天卵巢黄体数量增加;血清E2和P4水平明显升高;类固醇激素合成相关分子CYP19A1、CYP11A1、St AR的蛋白表达也显著升高。3.与对照组相比,HFD组小鼠D7天卵巢组织糖代谢通路相关基因Hk2表达降低,其余大部分基因表达无明显差异;HIF1-α、PDK1、PDP1、PDHA1的蛋白表达无明显差异;乳酸生成皆没有发生显著变化。4.与对照组相比,HFD组小鼠D7天卵巢组织脂质积累显著增加;脂肪酸合成相关基因（Acsl4和Elovl5）和参与脂肪酸转运相关基因（Slc27a4）,连同脂肪酸β-氧化相关基因（Cpt1a）表达升高;CPT1A蛋白表达升高;ATP水平升高;TCA循环和电子传递链的部分基因（Idh2、Ndufb6、Cox10）表达发生异常。5.体外结果显示,OA+PA干预并用h CG诱导黄体化对KGN细胞活力未产生影响;与对照组相比,OA+PA组KGN细胞上清E2和P4明显升高;类固醇激素合成相关分子CYP19A1、CYP11A1、St AR的蛋白表达也明显升高。6.与对照组相比,OA+PA组KGN细胞PFK2基因表达降低,其余与糖代谢通路相关基因表达无明显差异;HIF1-α、PDK1、PDP1、PDHA1的蛋白表达无明显差异;细胞上清乳酸生成皆没有显著变化。7.与对照组相比,OA+PA组KGN细胞发生脂质沉积;脂肪酸β-氧化（CPT1A）相关基因表达升高;CPT1A蛋白表达升高;ATP水平升高。8.乙莫克舍抑制KGN细胞脂肪酸β氧化后,相较于OA+PA组,抑制剂组脂质沉积进一步加深;但TCA循环和电子传递链（CS、IDH2、ATP5B）的部分基因表达和ATP水平有所降低;细胞上清E2、P4水平以及类固醇激素合成分子CYP19A1、CYP11A1、St AR相关蛋白的表达也明显降低。结论HFD诱导的肥胖可损害妊娠早期小鼠卵巢功能,且通过引起脂肪酸β-氧化途径异常,而非糖酵解异常,导致妊娠早期小鼠卵巢功能异常。