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儿茶素是茶树的主要次生代谢产物,也是决定茶叶品质及其健康功效的重要组分。茶树花青素还原酶(CsANR)可以催化花青素转变为相应的2,3-顺式-黄烷-3-醇,它是决定茶树儿茶素合成的直接酶类。作为原花青素生物合成途径中的关键酶,国内外研究者及本课题组前期工作已经对花青素还原酶基因及其酶学性质有了初步研究,但是也发现了很多疑问。 本文首先初步纯化了茶树鲜叶中和通过原核表达的CsANR蛋白,并采用C18柱和旋光异构柱分离,结合HPLC技术,鉴定了两种来源的ANR蛋白酶反应产物的差异。其次,利用原核表达的重组ANR蛋白,比较了两种重组ANR酶的酶学特性差异。 主要研究结果如下: 1.为排除茶树鲜叶中的氧化酶干扰,本文采取硫酸铵沉淀法,对CsANR酶进行了初步纯化。结果发现,CsANR酶反应产物更易于检测。利用C18柱和旋光异构柱分离,结合HPLC检测技术,对来自茶鲜叶的CsANR酶反应产物进行分析,结果表明,以矢车菊色素(CYA)和飞燕草色素(DEL)为底物时,CsANR酶生成的主要产物分别是2,3-顺式-黄烷-3-醇(-)EC和(-)EGC,没有发现2,3-反式-黄烷-3-醇产物C和GC的生成。 2.进行了CsANR1和CsANR2的原核表达。利用钴离子亲和树脂,对CsANR1和CsANR2融合蛋白进行了分离纯化,得到目的蛋白。利用C18柱和旋光异构柱分离,结合HPLC检测技术,对CsANR1和CsANR2融合蛋白进行酶活检测及产物鉴定。结果显示,以CYA为底物时,重组CsANR1或CsANR2酶生成的主要产物是(-)C和(+)EC;以DEL为底物时,重组CsANR1或CsANR2酶生成的主要产物是EGC和GC。在NADP+存在的条件下,没有检测到重组CsANR具有催化(+)C和(-)EC之间相互的差向异构作用。 以上结果提示,来自茶树鲜叶的蛋白与原核表达的重组蛋白之间的酶反应产物并不一致。 3、对重组CsANR1和CsANR2的酶学特性进行研究分析。结果表明,CsANR1酶的最适反应温度为40℃,最适pH值为6.5;CsANR2酶的最适反应温度为40℃,最适pH值为5.5。从底物特异性结果看,CsANR1酶以CYA为底物时的亲和力高于DEL,但DEL的Kcat/Km值却要高于CYA;而CsANR2酶以DEL为底物时的亲和力高于CYA,且DEL的Kcat/Km值也高于CYA。此外,大多数金属离子对两种酶有抑制作用,特别是Hg2+,在1mM的浓度下两种酶已完全失活。但Al3+在1mM浓度下却对CsANR1酶有促进作用。另外,通过对酶的稳定性研究,可以看出两种酶在低温下放置一段时间仍能保持较高的稳定性,在pH值5.0-8.0的缓冲液下两种酶活都相对稳定。 以上结论丰富了茶树儿茶素及其原花青素合成及其调控机理。