研究背景和研究目的听觉系统是重要的外周感觉系统,是动物获取外界信息重要的来源。听觉的产生与传导是一个极其精细与复杂的过程,需要多种信号的相互协调、转换以及传递来完成。在听觉系统中,内耳毛细胞是将外界的声音刺激转变成神经信号的感觉细胞。毛细胞能够感知外界环境中的声波刺激,并将它们转变成电信号传入大脑。在哺乳动物中,毛细胞被认为是不可再生的,毛细胞的丢失可能会导致永久性的听力功能的损伤。因此,毛细胞在听觉系统中发挥着至关重要的作用。内耳毛细胞最重要的结构特征是位于其上表面的听纤毛。在哺乳动物中,外毛细胞的听纤毛主要由三排高低不等呈阶梯状排列的静纤毛组成,外界声波的震颤引起毛细胞静纤毛的摆动,而静纤毛的偏转会引起机械电转导通道的开启,导致细胞外阳离子内流,从而将外界的机械信号转变为电信号,电信号进一步传输入大脑,从而使我们产生听觉。因此,静纤毛的完整性对毛细胞功能的维持起着至关重要的作用。细胞周期依赖性激酶5(CDK5)是一个重要的脯氨酸依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,在终末分化的细胞(如神经细胞)中高度表达。CDK5在许多细胞生理过程,如细胞骨架的调控、信号传导、基因表达以及细胞活性等中都起着酯关重要的作用,研究表明CDK5的活性调控异常是许多神经性性退行性疾病的如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森综合症等主要的致病原因。CDK5在内耳中高度表达,但是到目前为止,CDK5在听觉系统中的功能还不清楚。由于在神经系统中具有重要的生物学功能,CDK5全身性敲除小鼠大脑皮层层状细胞组构严重缺陷,导致小鼠围产期死亡,这大大阻碍了对CDK5生物学功能的研究。近年来,为了更好地研究CDK5的生物学功能,已经有不少条件性敲除小鼠被使用。本论文利用内耳特异性敲除工具小鼠在内耳中特异性敲除CDK5,阻断CDK5蛋白在内耳中的表达,并通过对敲除小鼠听力水平以及内耳毛细胞形态功能的检测,对CDK5在听觉系统中的功能进行详细深入的研究。此外,虽然CDK5与其他典型的CDK家族成员在结构上有一定的同源性,但与CDK家族其他成员明显不同的是,CDK5有自己特异的激活因子,已经发现的有p35、p39以及CCNI。我们前期的研究结果发现,p35、p39主要是在神经组织中表达,在内耳中的表达量很低,所以我们推测CDK5在内耳中可能存在其他的激活因子。为了寻找CDK5在内耳中的调控机制,我们利用酵母双杂交筛选内耳cDNA文库,得到了细胞周期蛋白I(CCNI)和细胞周期蛋白12(CCNI2)两个与CDK5相互作用的蛋白,并随后通过免疫共沉淀以及细胞荧光共定位等方法验证了相互作用。已有研究表明CCNI能够激活CDK5蛋白的激酶活性,并且能够参与细胞周期的调控。虽然CCNI2与CCNI是同源蛋白,但到目前为止,关于CCNI2功能的研究较少,所以CCNI2蛋白对CDK5激酶活性的影响以及在细胞生理过程调控中的功能在很大程度上还是未知的。本论文中,我们对CCNI2蛋白对CDK5激酶活性的调控做了检测,并深入探讨了 CCNI2对细胞周期以及细胞增殖的影响,这将为我们更好地研究CDK5在听觉系统中的功能提供重要信息。拟解决的科学问题在本论文中,需要拟解决的科学问题有以下几点:1)CDK5在小鼠听觉系统中的功能。2)CDK5调节内耳毛细胞发育的分子机制。3)CCNI2对CDK5激酶活性的调节作用。4)CCNI2对细胞周期以及细胞增殖的影响。研究方案及取得的研究成果为了回答以上科学问题,我们首先将Cdk5LoxP/LoxP小鼠与内耳特异性Cre小鼠交配得到了 Atoh1-Cre介导的CDK5内耳特异性敲除小鼠模型,即Atoh1-CDK5条件性敲除小鼠,并通过此小鼠模型对CDK5蛋白在小鼠听觉系统中的生物学功能进行系统的研究。ABR结果显示,Atoh1-CDK5敲除小鼠在一月龄时就出现了听阈上升的表型,并且随着年龄的增长出现渐进性的听力损失现象。DPOAE主要是检测外毛细胞的放大功能,敲除小鼠的DPOAE听阈与对照小鼠相比明显偏高。我们推测CDK5的敲除可能影响了毛细胞的功能,所以我们又通过FM1-43fx染料摄入实验对小鼠毛细胞静纤毛机械电转导通道的功能进行了检测。结果显示,敲除小鼠毛细胞在p8时就出现了 FMI-43fx染料摄入异常现象,而且随着年龄的增长有加重的趋势。为了更加清楚的观察毛细胞静纤毛的形态,我们通过phalloidin染色以及SEM对小鼠毛细胞进行观察,结果显示敲除小鼠从p8开始出现毛细胞静纤毛紊乱,p14开始出现毛细胞的缺失,随着时间的增进,敲除小鼠毛细胞缺失逐渐加重,在12个月时敲除小鼠基底膜底回区域毛细胞几乎已经全部丢失。根据毛细胞静纤毛紊乱与毛细胞丢失出现的时间差,我们认为可能是毛细胞静纤毛的紊乱导致毛细胞的丢失,从而引起小鼠听阈异常的表型。内耳毛细胞静纤毛主要是由肌动蛋白纤维F-actin以及相应的肌动蛋白连接蛋白组成,其中主要的肌动蛋白连接蛋白有ERM、fimbrin、villin和FASCIN2等,它们对毛细胞静纤毛结构的维持以及稳定起着至关重要的作用,肌动蛋白连接蛋白的异常可能会导致小鼠毛细胞静纤毛的组装异常,从而引起小鼠听力水平的下降。肌动蛋白连接蛋白ERM是CDK5的磷酸化底物之一,我们发现在敲除小鼠中ERM蛋白的磷酸化水平明显下降,由此推测,ERM蛋白的磷酸化水平下降可能是敲除小鼠内耳毛细胞中静纤毛肌动蛋白组装失败的一个重要原因。细胞外信号调节激酶(ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员,它也是CDK5的磷酸化底物之一。多种细胞外刺激都会引起ERK蛋白的磷酸化,使ERK蛋白活性被激活,而ERK活性的异常会影响细胞正常的生理过程,例如细胞存活、蛋白质合成、细胞增殖、生长、迁移和凋亡等。在我们的研究结果重显示,CDK5敲除小鼠内叶中ERK蛋白的磷酸化水平明显下降,我们由此推测,ERK蛋白的磷酸化水平下降可能在敲除小鼠毛细胞缺失过程中扮演了重要角色。为了能够找到毛细胞缺失的途径,我们利用Caspase3抗体通过小鼠内耳基底膜免疫组化实验检测敲除小鼠内耳毛细胞的凋亡情况,结果显示,在敲除小鼠内耳毛细胞中并没有检测到任何凋亡信号,这提示我们,毛细胞的缺失可能不是通过细胞凋亡途径实现的。随后,我们利用Atohl-CDK5小鼠与GFP-LC3转基因小鼠交配得到表达GFP-LC3转基因的Atohl-CDK5纯合小鼠,在小鼠内耳基底膜铺片结果中,我们观察到了 GFP-LC3点状聚集的增加,所以我们初步推测细胞自噬途径可能在敲除小鼠内耳毛细胞的丢失中发挥了重要作用。为了更加深入的了解CDK5在内耳中的调控机制,我们在前期的研究中通过酵母双杂交等实验方法发现了 CDK5的一个新的作用蛋白CCNI2。为了进一步证明CCNI2对CDK5的激活作用,我们继体外激酶实验以后又通过IP富集CDK5特异性磷酸化底物PAK1,并对其在不同激活因子存在的情况下的磷酸化水平进行了检测。结果显示,CCNI2能够激活CDK5的激酶活性,是CDK5的一个新的激活因子。同时我们还发现,CCNI2对CDK5的激活作用比CCNI对CDK5的激活作用要强,但是弱于p35对CDK5的激活效应。BrdU摄入实验以及MTT实验结果显示,利用干扰RNA将CCNI2在细胞水平敲低之后,细胞的增殖减慢。我们通过流式细胞仪检测CCNI2敲低之后细胞周期的变化,实验结果显示,CCNI2敲低之后G1期的细胞数目显著增多,S期的细胞数目显著减少,并且CCNI2对细胞周期的这种影响是依赖于CDK5蛋白的存在的。综上所述,CCNI2能够激活CDK5的激酶活性,参与细胞增殖以及细胞周期的调控,并且这种调控作用依赖于CDK5蛋白的存在。研究创新性及意义本论文以CDK5内耳特异性敲除小鼠为研究对象,对CDK5蛋白在小鼠听觉系统中的功能进行了深入的探讨。我们得到的创新研究成果及意义主要有以下两点:1.以内耳特异性敲除CDK5小鼠为研究对象,发现敲除小鼠毛细胞静纤毛发生紊乱甚至丟失,毛细胞死亡,小鼠听力异常。这些结果表明CDK5在小鼠内耳发育过程中,对毛细胞静纤毛的发育维持以及毛细胞的存活起着非常重要的作用。2.我们发现CCNI2是一个新的CDK5激活因子,可以调控细胞增殖以及细胞周期,并且这一调控过程依赖于CDK5蛋白的作用。这一发现为我们深入认识CDK5的调控机制提供了重要信息。