论文部分内容阅读
背景和目的克唑替尼是一种针对间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因重组、c-MET基因扩增和ROS基因重组的多靶点酪氨酸激酶抑制剂。已广泛用于ALK阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者的标准一线治疗。然而,克唑替尼引起的肝损伤是临床医生面临的主要挑战之一,且其机制目前尚不十分清楚。RNA甲基化是除了 DNA甲基化和组蛋白修饰之外的另一种表观遗传修饰方式。在已经鉴定的150多种RNA修饰中N6-甲基腺苷(m6A)修饰是真核mRNA中最丰富的修饰,它在多种生物学过程和疾病发生发展中发挥着重要的作用。现有一些研究显示,表观遗传修饰在肝毒性中也发挥了重要的作用。迄今为止,尚未有任何关于m6A与药物克唑替尼诱导的肝损伤之间的机制有联系的报道,因此,对克唑替尼诱导的肝损伤小鼠模型中m6A甲基化水平进行定量分析是非常有必要的。本研究的目的是通过探索建立克唑替尼肝损伤小鼠模型的方法;进一步开发和验证一种可靠的测定mRNA中五种核苷的串联质谱超高效液相色谱(LC-MS/MS)方法;得以考察克唑替尼肝损伤小鼠肝组织mRNA种m6A甲基化修饰水平的变化。方法1 克唑替尼肝损伤小鼠模型的建立购买自北京维通利华实验动物技术有限公司的ICR小鼠被随机地分为两个组别:模型组和对照组,且以0.5%CMC-Na作为溶媒,模型组的小鼠需每天灌胃不同剂量(100 mg/kg、300 mg/kg和500 mg/kg)的克唑替尼,对照组的小鼠则每天灌胃相应的0.5%CMC-Na,所有组别均给予正常饲料,每天进行观察和称量体重并记录下来,并根据实验目的于不同的时间,收集各个组别小鼠的血清和肝脏组织,检测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)两项生化指标,观察肝组织细胞形态变化。2 LC-MS/MS测定克唑替尼肝损伤小鼠肝组织mRNA中m6A的含量开发mRNA中五种核苷(腺嘌呤核苷,尿嘧啶核苷,胞嘧啶核苷,鸟嘌呤核苷和m6A)的LC-MS/MS测定方法。提取各个组别小鼠肝脏组织mRNA,并将mRNA通过核酸内切酶和碱性磷酸酶酶解为单个核苷,核苷样品在Acquity UPLC色谱柱上进行分离,使用甲醇和0.02%甲酸水进行梯度洗脱,通过Qtrap 4500质谱仪以电喷雾电离模式进行检测。腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷的浓度范围为4～800 ng/mL,m6A的浓度范围为0.1～20 ng/mL,并对其进行完整的方法学验证。采用建立的测定方法分析克唑替尼肝损伤小鼠肝组织mRNA中m6A甲基化修饰水平。结果1 克唑替尼肝损伤小鼠模型的建立1.1 克唑替尼对小鼠血清生化指标的影响与对照组的小鼠相比,模型组ICR小鼠灌胃给予克唑替尼500 mg/kg连续4天,血清中ALT和AST均显著升高。实验对6组ICR小鼠血清中ALT和AST的水平进行了组内的雌雄比较,结果显示,本实验高剂量灌胃小鼠血清中ALT和AST的水平无雌雄差异。1.2 克唑替尼对小鼠体重及肝组织病理的影响与对照组的小鼠相比,模型组小鼠灌胃给予500 mg/kg克唑替尼连续4天,小鼠体重于第3天开始显著下降。此外,模型组小鼠肝组织病理切片显示,小鼠肝细胞出现中度至重度的水肿变性,胞质疏松淡染并可见微小的圆形空泡。2 LC-MS/MS测定克唑替尼肝损伤小鼠肝组织mRNA中m6A的含量2.1 酶解mRNA为单核苷处理方法的优化通过系列浓度梯度优化的方法最终确定S1核酸内切酶和碱性磷酸酶的最适加入量分别为180U(1 μL,180 U/μL)和2U(2μL,1 U/μL)。通过对不同孵育时间的优化确定mRNA酶解反应在37℃的条件下6h内几乎完成,且随时间的延长(6-12 h)酶解产物的量保持恒定。因此,酶解孵育的最佳时间是6 h。2.2 质谱条件和色谱条件的优化优化得到A、U、C、G和m6A的主要离子质子化分子离子[M+H]+分别为m/z 268.1、m/z 245.1、m/z 244.2、m/z 284.2 和 m/z 282.1,产物离子分别为 m/z 136.1、m/z 113.0、m/z 112.0、m/z 152.1 和 m/z 150.1。此外,内标 IS 的 MRM 离子对为m/z 243.1→m/z 127.0,用于定量分析。色谱条件选用Acquity UPLC HSS T3色谱柱(1.8 μm,100 mm×2.1 mm i.d,Waters)分离五种核苷,流动相为甲醇和0.02%甲酸水溶液,同时采用梯度洗脱的方法。2.3 小鼠肝组织mRNA中五种核苷的LC-MS/MS测定方法的评价腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷的浓度范围为4～800 ng/mL,m6A的浓度范围为0.1～20ng/mL。五种核苷在各自的浓度范围内线性关系良好,特异性好,精密度和准确度、基质效应、残留效应和样本稳定性均符合生物样本的测定要求。2.4 小鼠肝组织mRNA中核苷水平的测定测定克唑替尼诱导的肝毒性模型小鼠肝脏组织mRNA中五种核苷的水平。小鼠肝脏组织mRNA中甲基化修饰核苷m6A的含量以m6A与A的浓度之比表示(m6A/A%=Cm6A/CA×%)。结果显示,克唑替尼肝损伤组小鼠肝脏组织mRNA中的m6A/A%值显著低于对照组(p<0.001)。结论1.本研究成功建立了克唑替尼肝损伤小鼠模型,造模方法为ICR小鼠灌胃给予500 mg/kg克唑替尼连续4天。2.开发并验证了一种测定mRNA中五种核苷(腺嘌呤核苷,尿嘧啶核苷,胞嘧啶核苷,鸟嘌呤核苷和m6A)的LC-MS/MS方法,该方法准确可靠。此外该方法成功地用于克唑替尼肝损伤小鼠肝脏mRNA中五种核苷(A、U、C、G和m6A)的测定。3.与对照组相比,克唑替尼肝损伤小鼠肝组织mRNA中m6A甲基化水平显著降低。