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水曲柳(Fraxinus mandshurica)具有较高的经济价值,是我国Ⅱ级重点保护野生植物。多年来,国内外关于水曲柳生理特性、杂交育种、碳氮代谢、组织培养等方面已有大量报道,但基于与抗旱相关的ABA应答基因的分子生物学和基因工程方面的研究还未见报道。本研究旨在通过水曲柳逆境胁迫响应基因FmSnRK2.6和FmSnRK2.10的同源克隆、生物信息学分析、表达载体的构建、过表达材料在胁迫处理下生理生化指标的检测分析FmSnRK2.6和FmSnRK2.10转录因子基因的功能,为进一步了解SnRK2基因的特性、功能以及利用基因工程手段对水曲柳耐旱品种的培育提供理论依据。1、在水曲柳干旱胁迫响应转录组中寻找并克隆得到两个SnRK2转录因子基因,且将其命名为FmSnRK2.6和FmSnRK2.10。经多序列比对,确认所得基因归属于SnRK2家族。FmSnRK2.6基因含有1089bp的编码阅读框,编码362个氨基酸。其编码蛋白的分子量为41015.5Da,等电点为4.83。FmSnRK2.10基因含有1074bp的编码阅读框,编码357个氨基酸。其编码蛋白的分子量为41.01kDa,等电点为5.43。FmSnRK2.6和FmSnRK2.10均含有ATP结合位点及该蛋白激酶的特定保守结构域(Ser/Thr酶活结构域),且均为亲水蛋白。2、根据所得基因设计特异引物,使用Infusion克隆法将目的基因FmSnRK2.6和FmSnRK2.10与pROKⅡ载体连接得到重组的植物表达载体,通过三亲杂交法将重组载体导入农杆菌中并筛选得到转化的农杆菌。根据农杆菌介导的遗传转化技术,对水曲柳遗传转化的条件进行了初步探索。将水曲柳外植体置于含有不同浓度梯度卡那霉素的愈伤诱导培养基中进行培养,当kan浓度为80mg/L时,愈伤组织诱导率为0;分别使用水曲柳叶片、叶柄、茎段及根为外植体材料,在不同的共培养时间及延迟处理条件下进行遗传转化,结果显示,当以根外植体材料在共培养两天且无延迟处理的遗传转化条件下转化效率最高。3、以转FmSnRK2.6和FmSnRK2.10基因的水曲柳愈伤组织为试材,以未进行遗传转化的水曲柳愈伤组织为对照进行20%PEG及20%PEG+3 00μmol/LABA胁迫处理。与对照组相比,过表达材料中SnRK2.6、SnRK2.10、ABA信号转导途径中的相关基因PYR1、防御酶类基因POD1及SOD的表达显著上调,脯氨酸含量及抗氧化酶类POD和SOD的活性显著增多,而膜脂过氧化产物MDA的含量有所减少,表明FmSnRK2.6和FmSnRK2.10的过表达增强了转基因水曲柳愈伤组织的抗旱性。