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本研究以麻疯树(Jatropha curcas L.)为研究材料,克隆了七个油脂合成关键基因,其中:酰基-ACP硫酯酶(TEs)基因JcFATA1、JcFATB1;ω-6脂肪酸脱氢酶(FAD)基因JcFAD2、JcFAD6;ω-3脂肪酸脱氢酶基因JcFAD3、JcFAD7和JcFAD8。检测了这些基因在麻疯树中的表达情况,同时,成功将这些基因转入拟南芥,进行了初步功能分析,得到如下结果:
1.根据氨基酸序列比对设计兼并引物,PCR扩增得到基因片段,然后通过RACE方法从麻疯树中克隆到JcFATA1、JcFATB1、JcFAD3、JcFAD6和JcFAD8五个基因,在GenBank中进行了登录,登录号分别为EU267122、EU106891、EU267121、EUl06889、EU106890。根据GenBank中的序列号为DQ157776、DQ452089的序列,设计特异引物扩增克隆到JcFAD2和JcFAD7基因。序列分析表明,这些基因均为核基因编码,由于其所编码蛋白质存在不同的信号肽,JcFATA1、JcFATB1、JcFAD6、JcFAD7和JcFAD8定位于质体,JcFAD2、JcFAD3定位于内质网。
2.利用半定量RT-PCR检测了这七个基因在麻疯树中的表达情况,结果表明:除JcFAD6在根中几无表达和JcFAD3在叶、花中几无表达外,各基因在麻疯树的不同组织中均有表达,与其它组织中的表达情况比,JcFATB1、JcFAD2在种子中的表达量最高;随着种子的不断发育直到成熟,种子的脂肪酸组份处于不断的变化中,相应的各脂肪酸合成途径相关基因的表达也有变化,JcFAD2基因的表达在种子的发育过程中基本恒定,JcFATB1在种子发育的后期表达量递增,JcFATA1、JcFAD8随着种子的发育表达量不断增加,而JcFAD3、JcFAD6两个基因表达量减少。
3.从拟南芥中克隆了种子特异表达基因At2s3的启动子,构建了由At2s3启动子驱动的各基因的表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥获得转基因植株(除JcFAD7、JcFAD8未获转基因植株),气相色谱(GC)法分析了转基因株系种子脂肪酸组份。结果表明:JcFATA1、JcFATB1的超表达提高了种子中饱和脂酸酸的含量,JcFATA1转基因种子中C18:0的含量增加了1~2倍左右,JcFATB1转基因种子中C16:0组分由9.0 m01%左右(野生型种子中)增加到30.4mol%,最高的达40.9 m01%,当然,相应地这两个基因的转基因材料中不饱和脂肪酸含量均有所降低,由此可见酰基-ACP硫酯酶(TEs)在控制油脂饱和度和碳链长短方面有重要作用;JcFAD2的超表达显著地提高了种子中C18:2的含量,同时C18:3的含量和C20:2的含量也有所增加,这些组份的增加伴随着C18:1含量的降低,而.JcFAD6的超表达对种子脂肪酸组份没有影响,可见JcFAD2的表达能明显提高种油中多不饱和脂肪酸的含量;JcFAD3的超表达显著地提高了种子中C18:3的含量,从15.8 mol%左右提高至20.2 mol%,最高达24.1 mol%,而C18:2的量显著下降。
4.构建了由CaMV35S驱动各基因的组成型表达载体,并已经转化拟南芥获得转基因植株纯合体(除.JcFATA1未获纯合体外),克隆并分析了ω-3脂肪酸脱氢酶基因的启动子,为将来研究脂肪酸组份变化与植物对胁迫耐受的关系打下了基础。
本论文的研究结果初步鉴定了几个基因的功能,进一步明晰了麻疯树的油脂代谢过程,为将来有目的性改良麻疯树的脂肪酸组份打下了良好的理论基础。