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近年来,氧化应激作为骨质疏松（osteoporosis,OP）的一个危险因素已受到高度重视。重金属镉（Cadmium,Cd）,因其毒性可致细胞内离子稳态失衡、抗氧化系统损伤、线粒体受损,从而导致ROS增加。ROS的增加,可导致氧化应激效应,激活FoxO通路和抑制Wnt通路,导致骨密度（bone mineral density,BMD）下降、骨质流失等骨质疏松症状。氧化应激诱发OP的主要机制有两个方面,一是离子稳态失衡、线粒体膜受损、线粒体依赖性通路激活,引起细胞凋亡;二是抑制骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）表达,激活核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL）表达,活化破骨细胞,促进骨吸收。因此,应用具有抗氧化活性的物质可能是防治OP的新靶点。黄酮类化合物大多具有酚羟基结构,可与金属离子生成稳定的螯合物,阻止金属离子催化生成氧自由基,终止脂质过氧化反应;还可作为自由基的受体阻碍自由基连锁反应,从而起到抗氧化作用;有人报道,蕨麻黄酮类化合物（PAF）对食用油脂有较强的抗脂质过氧化作用和抑制自由基产生,抗自由基能力优于维生素C和柠檬酸。由此,可推测PAF可能抑制Cd染毒引起的ROS过度蓄积,拮抗氧化应激,从而抑制FoxO信号通路因子、激活Wnt通路,发挥抗OP作用。目的:基于上述结果,本研究以ROS增加是OP发病的起因为主题,以氧化应激致OP发病的机制为主导,模拟骨细胞氧化应激和动物氧化应激性OP,建立Cd染毒细胞及OP动物模型。在梯度浓度PAF和NAC干预下,通过抗氧化、抗凋亡、相关蛋白表达、骨质及其生物力学等实验研究,探讨PAF抗OP活性及其机制。为进一步认识OP发病机制、Cd骨氧化毒性以及OP防治提供实验依据,也为蕨麻的开发利用提供思路。方法:1.微波辅助乙醇提取法提取青海玉树秋季蕨麻的PAF。2.Cd梯度浓度染毒MC3T3-E1细胞、BALB/c雄性小鼠,建立Cd细胞毒性和OP动物模型,主要以BMD、骨组织形态计量学、骨生物力学的变化作为OP模型成功的评价指标,确定Cd造模剂量。3.体外抗氧化实验和MC3T3-E1细胞培养检测PAF抗氧化能力。4.显微和超微观察、比色法、CCK-8和流式细胞术、生化法、ELISA法、Western Blot、qRT-PCR等方法,观察和检测ROS、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力和丙二醛（MDA）含量及磷酸化p66shc蛋白表达;血清碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白（Bone Gla Protein,BGP）、OPG、RANKL及人抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP5b）水平;细胞生存率和凋亡率、细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)、线粒体膜电位（MMP）、凋亡相关蛋白;成骨及成脂分化调控因子以及FoxO3a与Wnt信号通路中相关基因与蛋白的表达水平。5.检测BMD、骨组织形态计量学、骨生物力学变化;HE染色及透射电镜观察骨组织结构变化。结果:1.微波辅助乙醇提取法提取青海玉树秋季蕨麻的PAF。最佳条件为:乙醇浓度50%、料液比1:25、微波时间20 min、微波温度70℃。提取量:14.63±0.21mg/g。2.在体外,PAF在3.125 mg/L浓度即有抗氧化活性,而细胞内25 mg/L效果明显,并有明显的量-效关系。3.Cd梯度浓度染毒MC3T3-E1细胞,其终浓度达到30μM,ROS含量最高,Cd梯度浓度染毒BALB/c雄性小鼠,浓度达2 mg/kg出现BMD、骨组织形态计量学、骨生物力学的变化。4.PAF干预,可使Cd染毒细胞和骨质疏松动物模型GSH-Px、SOD和CAT升高,ROS、MDA含量及磷酸化p66shc蛋白表达降低;[Ca2+]i浓度明显下降、MMP恢复,Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及ATPase活性增加,Bcl-2表达增加、Bax表达降低,Bcl-2/Bax比值升高、细胞色素C（Cytochrome C,Cyt C）、凋亡诱导因子（Apoptosis-inducing factor,AIF）、Cleaved caspase-3蛋白的表达下降,细胞生存率增高、凋亡率下降;血清ALP、BGP、OPG及OPG/RANKL升高;而RANKL和TRACP5b表达降低;提高成骨分化、降低成脂分化相关调控因子表达;降低FoxO3a蛋白及Gadd45α基因的表达,同时提高Wnt信号通路中β-catenin蛋白及靶基因Axin2的表达。5.PAF干预,股骨BMD明显升高,骨小梁厚度、骨小梁体积分数显著增加,骨小梁间距变小;最大载荷和弹性模量显著升高;改善骨组织超微结构的损伤。结论:1.初次用微波辅助乙醇提取法提取青海玉树秋季蕨麻PAF,最佳条件下提取量为14.63±0.21 mg/g。2.初次利用Cd氧化毒性建立OP动物模型。Cd致毒剂量,细胞:CdCl2 30μM;小鼠:CdCl2 2 mg/kg,可分别用于建立细胞毒性和OP动物模型。3.PAF无毒性,有效抗氧化剂量,细胞6.2525 mg/L;小鼠1.5 mg/kg。4.Cd的骨毒性源于氧化应激反应、[Ca2+]i稳态失衡、细胞凋亡、激活RANKL/RANK/OPG信号通路,促进骨吸收,导致OP。PAF有较好的抗氧化、稳定离子平衡、保护骨细胞活性、抑制骨吸收,调节骨吸收与骨形成平衡,实现抗OP的作用。5.Cd毒性诱导凋亡的途径是线粒体依赖性凋亡通路。PAF通过保护线粒体膜、稳定ATP酶活性、升高Bcl-2/Bax比值,下调CytC、AIF、Cleaved caspase-3蛋白表达调节线粒体依赖性凋亡通路。6.Cd骨毒性通过抑制负责成骨分化的Wnt/β-catenin信号通路,激活FoxO3a转录因子及靶基因,诱导产生氧化应激,抑制骨形成,从而促进OP发生。PAF能够通过调控FoxO3a/Wnt信号通路发挥抗OP的作用。