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研究背景与目的肾细胞癌（RCC）是肾恶性肿瘤的主要临床类型。肾癌细胞的生物学研究揭示,肿瘤抑制基因VHL被认为与。肾癌的发病有关。人类VHL基因定位于染色体3p25-26区,全长约15kb,其编码产生的VHL蛋白由包含不同的蛋白结合位点的结构区域构成:α-区可以与转录延长因子B-C（Elongin B-C）复合物相连接,B-区可以与低氧诱导因子1α（HIF-1α）等底物分子相连接。进一步研究发现,VHL蛋白实际与Elongin B-C、CUL2蛋白组成VBC（VHL-ElonginB/C-CUL2）复合物,该复合物被证实属于E3-泛素蛋白酶（E3-ubiquitin-proteasome）系统,参与人体内多种蛋白的降解过程,进而实现对细胞因子的抑制,从而调节细胞周期并抑制细胞增殖,这是传统研究证实的VHL蛋白的一项重要功能。而本研究的基础理论则涉及到了VHL基因抑癌作用的另一个机制,即阻断肾癌细胞的增殖、转移的必需信号——胰岛素样生长因子Ⅰ（insulin-like growth factorⅠ.IGFⅠ）受体信号。阻断该信号系统可以治疗RCC。VHL抑癌基因蛋白质氨基端β结构域的（104—123）的20氨基酸短肽具有VHL蛋白质一样的作用,封阻IGF受体胞浆结构域同其下游信号分子-蛋白激酶（protein kinase Cδ）的相互作用,抑制了protein kinase Cδ的活化,能够抑制RCC生长,并促进其凋亡。然而,和其它小肽一样,应用VHLβ结构前肽这种生物活性肽来治疗RCC形成受到许多因素限制:首先是需要反复注射,用量较大,目前主要来源于体外合成,其价格昂贵;第二,肽的半衰期短,只有几分钟到几十分钟,其水溶液稳定性差,容易降解,因而作用时间短暂;第三,肽的生物利用率低,缺乏组织特异性,膜通透性差等也限制了其进一步的临床应用。因此我们设想应用VHLβ结构前肽治疗肿瘤的一种可能的选择是设计一种方法能在一段相当长的时间内在肿瘤组织中合成和释放内源性的VHLβ结构前肽,从而达到治疗的目的。本研究旨在:（1）克隆VHLβ结构前肽基因片段并进行序列分析;（2）采用HIV的TAT膜渗透肽作协助肽并加用标签肽的编码序列6×His重组表达质粒pGEM-T-TAT-6×His-VHLβ结构前肽cDNA序列的构建;（3）在VHLβ结构前肽的5’端融合神经营养素4（NT4）的信号肽和引导肽,构建融合基因NT4-TAT-6×His-VHLβcDNA;（3）构建可分泌表达VHLβ结构前肽的重组腺伴随病毒;（4）应用可分泌表达VHLβ结构前肽的重组腺伴随病毒体外转染培养的Hela细胞,观察其在真核细胞中的表达;（5）通过该重组腺伴随病毒体外转染培养的肾癌细胞,观察细胞中VHLβ结构前肽的表达,阐明分泌表达VHLβ结构前肽的rAAV转染是否影响肿瘤细胞的生长,为其临床应用奠定基础,从而为肿瘤抑制融合肽的基因治疗提供一个新的有效的途径。研究方法和结果（1）根据GenBank提供的VHLβcDNA序列,分别设计合成VHL的β结构区104-123短肽cDNA的正向和反向引物以及编码TAT-6×His cDNA的正、反向引物,使用互为引物模板PCR方法,扩增获得具有NaeⅠ/Eco721酶识别位点的TAT-6×HiscDNA片段和具有Eco721/BamHⅠ酶识别位点的VHLβ抑制肽cDNA片段,将两个片段分别克隆到pGEM-T easy中。酶切鉴定,所克隆的两片段连同酶切位点分别为69bp、75bp,表明TAT-6×His（融合肽前片）和VHL（融合肽后片）cDNA片断插入到pGEM-T easy载体中。（2）将扩增的VHLβ结构前肽cDNA,与pGEM-T-TAT-6×His连接,构建成重组质粒pGEM-T-TAT-6×His-VHLβ结构前肽cDNA。转化细菌并筛选阳性克隆、酶切鉴定后进行序列测定和分析。所克隆的TAT-6×His-VHLβcDNA片段（132bp）,包括VHLβ结构前肽cDNA片段（114bp）、1个终止密码（3bp）和2个限制性内切酶NaeⅠ和BamHⅠ的识别序列（15 bp）,表明TAT-6×His-VHLβ结构前肽cDNA片断插入到pGEM-T easy载体中。将从转化菌中提取的质粒送上海生工生物工程有限公司进行序列测定表明,克隆的TAT-6×His-VHLβ结构前肽cDNA片段的序列与GenBank提供的已知序列一致。（3）将测序正确的TAT-6×His-VHLβcDNA亚克隆于载有NT4信号肽和引导肽区基因的原核表达载体pBV220/NT4中,构建了真核细胞异源信号肽和引导肽序列引导的VHLβ结构前肽融合基因。使用EcoRⅠ和BamHⅠ联合酶切,可以从重组质粒上切出363bp的插入片段,表明TAT-6×His-VHLβcDNA片段与NT4的信号肽和引导肽的cDNA已经成功融合,重组表达质粒pBV220-NT4-TAT-6×His-VHLβ结构前肽cDNA的构建成功。（4）将融合基因NT4-TAT-6×His-VHLβcDNA亚克隆于腺伴随病毒的穿梭质粒pCCMV.pLpA中;并采用三质粒一步转染法,以pAAV/Ad替代野生腺病毒包装可分泌表达VHLβ结构前肽的rAAV/NT4-TAT-6×His-VHLβ;采用硫酸铵沉淀法纯化病毒粗制液;制备地高辛标记的AAV基因片段作为探针,应用斑点杂交法检测rAAV滴度。限制性内切酶酶切鉴定证实:StyⅠ可以将pSSHG/NT4-TAT-6×His-VHLβ质粒线性化,使用EcoRⅠ和BamHⅠ联合酶切,可以从重组质粒上切出363bp的融合基因插入片段,结果表明NT4-TAT-6×His-VHLβcDNA片段已经成功的插入到腺伴随病毒穿梭质粒pSSHGCMV载体中;参照斑点杂交结果,可计算出本次实验重组病毒的滴度为3.4×1010/ml。（5）将可分泌表达VHLβ结构域肾癌抑制融合肽的重组腺伴随病毒体外转染培养的Hela细胞,免疫细胞化学染色显示在转基因细胞组融合肽表达明显增高,与对照组相比有显著性差异（P＜0.01）。（6）将可分泌表达VHLβ结构域肾癌抑制融合肽的重组腺伴随病毒体外转染培养的肾癌细胞株GRC-Ⅰ,观察其形态学改变并进行MTT测定和流式细胞术检测。结果显示:实验组和对照组的细胞在形态学上无显著差异,MTT检测和流式细胞术结果表明,与对照空病毒组相比,在转基因模型细胞中过量表达的VHLβ结构域肾癌抑制融合肽显示了细胞毒性效应,诱导细胞产生了以凋亡方式为主的细胞死亡。结论（1）克隆出TAT-6×His-VHLβcDNA基因并进行了序列分析比较,序列测定的结果表明,所克隆出的DNA序列与GenBank提供的已知序列完全相同。为深入开展应用VHLβ结构前肽进行基因治疗创造了条件。（2）采用基因克隆技术,成功扩增了编码TAT膜渗透肽和6×His标签肽以及VHL抑癌基因β结构域肾癌抑制肽的cDNA片段,成功构建了具有NT4信号肽的TAT-6×His-VHLβ融合肽cDNA克隆。为进一步使用编码分泌表达膜渗透肽和标签肽以及VHLβ结构域肾癌抑制肽的融合基因治疗。肾癌奠定了基础。（3）构建了NT4-TAT-6×His-VHLβ重组腺伴随病毒,在真核细胞内包装出能分泌表达VHLβ结构域肾癌抑制肽的重组腺伴随病毒rAAV/NT4-TAT-6×His-VHLβ。此rAAV感染Hela细胞,免疫细胞化学染色显示此重组病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。（4）将可分泌表达VHLβ结构域肾癌抑制融合肽的重组腺伴随病毒体外转染培养的肾癌细胞株,显示了对肾癌细胞的毒性效应,并诱导细胞产生了以凋亡方式为主的细胞死亡。