研究背景:环状RNAs（circular RNAs,circRNAs）是通过反向剪接形成的单链共价封闭的环状RNA分子,其没有5’端帽子和3’端多聚A尾结构,表达稳定,不受RNA核酸外切酶和RNaseR降解;含量丰富,是相应的线性mRNAs的10倍以上;具有组织和发育阶段的特异性。现已证实在多种肿瘤组织及细胞中存在特异性circRNAs表达,与肿瘤患者TNM分期、淋巴结转移、血管侵犯等临床病理参数及预后密切相关,可作为相关肿瘤预警标记物及分子治疗靶点。CircRNAs是重要的调控因子,可以通过多种机制,例如与靶蛋白直接结合,影响靶基因与启动子的结合能力,调控靶蛋白亚细胞定位,内源竞争RNA（ceRNA）等多种机制调控靶基因表达,参与多种肿瘤细胞生物学行为的调控。目前胃癌组织中特异性表达circRNAs尚不明确,其对胃癌细胞生物学行为的影响尚不清楚。Hsacirc1483位于人类5号染色体,具有核糖体结合位点,在正常脑组织、恶性胶质瘤细胞中均存在表达,其与胃癌发病风险及生物学行为的关系如何,目前尚无报道。功能预测表明hsacirc1483表达可能与DHX29基因有关,可与RNA结合蛋白EIF4A3结合。研究表明DHX29是一种RNAJ解旋酶,其基因敲出后可减低蛋白翻译和细胞增殖受抑。EIF4A3基因编码DEAD-box蛋白家族是调控胚胎发育、精子生成及细胞生长分裂中关键因子。因此hsacirc1483表达可能参与细胞分化、增殖。Hsacirc1483究竟能否调控胃癌细胞的增殖分化,目前尚不清楚。Let-7c是let-7家族成员之一。研究表明let-7c是调控细胞分化、增殖的作用因子。例如,let-7低表达可诱导CD8 T细胞向细胞毒性T淋巴细胞转化,介导TCR信号通路,促进细胞增殖,激发机体抗肿瘤免疫应答。在急性粒细胞白血病中,let-7c通过抑制靶基因PBX2,促进白血病细胞由粒系向单核系转化,诱导细胞的成熟表型转化。Let-7b通过下调靶基因基质金属蛋白酶1（MMP1）表达,抑制牙尖干细胞的成骨分化能力,降低成骨标志物转录水平的表达。近年发现let-7c表达受到其他非编码RNA调控。本课题组前期通过生物信息学预测分析表明hsacirc1483可对let-7c进行上游调控,该预测结果有待进一步证实。胃蛋白酶原C（Pepsinogen C,PGC）基因是胃黏膜终末分化基因。本室前期研究聚焦于PGC 3’-UTR区的调控机制,经荧光素酶实验验证,筛选出5种miRNAs以PGC为靶标,进一步血清学验证发现血清let-7c与血清PGC的蛋白表达显著负相关,表明PGC基因可能是let-7c的下游靶基因,提示let-7c可能参与胃黏膜细胞的分化调控,该研究结果有待进一步证实。研究目的:1、探讨hsacirc1483在胃癌组织及癌旁组织的差异表达及其与临床病理参数以及PGC基因表达的相关性,明确hsacirc1483对胃癌的诊断价值。2、探讨hsacirc1483对胃癌细胞生物学行为的影响。3、探讨hsacirc1483能否通过与let-7c靶向结合,参与调控胃癌细胞分化的机制。研究方法:第一部分:Hsacirc1483在胃癌与癌旁组织的差异表达及其与胃黏膜分化基因PGC表达的相关性1、收集中国医科大学附属一院2013年11月至2017年9月收治的胃癌手术患者癌组织及癌旁正常组织标本57对。通过病历记录收集所有研究对象的年龄、性别、吸烟、饮酒等相关临床病理资料,包括TNM分期、淋巴结转移、生长方式、脉管侵犯、Lauren分型等。本研究得到中国医科大学附属一院伦理委员会批准。2、通过组织总RNA提取、cDNA第一链合成和实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术,检测hsacirc1483与PGC mRNA的组织表达情况。以2-△ct表示hsacirc1483与PGC mRNA的相对表达量,△CT=CT目的基因-CT内参基因。3、采用Mann-Whitney U非参数检验分析hsacirc1483的组织表达在胃癌及癌旁组织两组间的差异性。利用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析hsacirc1483组织表达区分胃癌的敏感度及特异度。采用Spearman’s correlation coefficient方法分析hsacirc1483与PGC表达的相关性。第二部分Hsacirc1483表达对胃癌细胞生物学行为的影响1、hsacirc1483过表达质粒构建:选取GV486为hsacirc1483的过表达质粒载体,并经酶切确定。化学合成hsacirc1483基因序列,用KpnI/BamHI酶切含有目的基因的质粒,将酶切产物连接入线性化表达载体,经PCR鉴定。2、基线低表达和中等程度表达的hsacirc1483胃癌细胞系的筛选:通过细胞总RNA提取、反转录和Real-time PCR方法,检测hsacirc1483在MGC803、HGC27、SGC7901、BGC823、AGS和MKN45胃癌细胞系中以及在正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达量,选取hsacirc1483相对低表达和中等程度表达的三株胃癌细胞系HGC27、BGC823、AGS进行后续实验。3、细胞转染效率检测:应用细胞培养技术、细胞瞬时转染技术,将构建的hsacirc1483过表达质粒瞬时转染至所选取的HGC27、BGC823、AGS细胞系中,转染24h后更换细胞培养基,并在荧光显微镜下观察绿色荧光,质粒的转染效率达50%以上进入下一轮实验。4、Hsacirc1483过表达细胞分化相关指标表达检测:胃癌细胞系在转染hsacirc1483过表达质粒或对照质粒24h后,收集细胞沉淀。利用细胞总RNA提取、反转录和Real-time PCR方法,鉴定hsacirc1483在胃癌细胞中的过表达效率及检测PGC、SOX2、CDX2、TFF2 mRNA表达水平。同时,通过细胞蛋白提取、SDS-PAGE电泳、免疫印迹实验检测PGC、SOX2、CDX2、TFF2蛋白表达。5、Hsacirc1483过表达细胞增殖检测:胃癌细胞中hsacirc1483过表达质粒或对照质粒瞬时转染24h后,将细胞消化离心,铺96孔板,分别在铺板后的24h、48h、72h进行细胞增殖毒性检测（CCK-8）。6、统计分析:hsacirc1483、PGC、SOX2、CDX2、TFF2 mRNA的相对表达量以2-△△ct表示,△△CT=（CT目的基因-CT内参基因）实验组-（CT目的基因-CT内参基因）对照组。对照组中目的基因mRNA表达设为单位1。采用Graphpad Prism6进行统计分析和图形处理。以配对样本T检验比较两组的差异表达。所有数据均采用均数±标准差表示。第三部分Hsacirc1483靶向结合let-7c参与胃癌细胞分化调控的分子机制研究1、双荧光素酶实验:在3’UTR报告基因系统中,将hsacirc1483 3’UTR区域构建至报告基因luciferase的下游,观察过表达let-7c后荧光素酶的活性变化,以定量反映let-7c对hsacirc1483的抑制作用。荧光素酶实验设立4组:hsacirc1483+let-7c、hsacirc1483-nc+let-7c、hsacirc1483-mut+let-7c、hsacirc1483-mut+let-7c-nc,组间比较hsacirc1483 3’-UTR是否通过与let-7c靶向互补结合,导致荧光素酶活性降低。2、基线中等程度表达、高表达的let-7c胃癌细胞系的筛选:通过细胞总RNA提取、反转录和Real-time PCR方法,检测let-7c在MGC803、HGC27、SGC7901、BGC823、AGS和MKN45胃癌细胞系中以及在正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达量,选取let-7c中等程度表达、高表达的三株胃癌细胞系HGC27、AGS、BGC823进行后续实验。3、细胞转染效率检测:应用细胞培养、细胞瞬时转染,将let-7cmimics转染到BGC823、AGS细胞系中,let-7c inhibitor转染至HGC27、BGC823细胞系中。瞬时转染6h后更换细胞培养基,在荧光显微镜下观察绿色荧光,其转染效率达50%以上进入下一轮实验。4、let-7c过表达及沉默细胞分化相关指标表达检测:let-7c转染胃癌细胞系48h后,收集细胞沉淀,利用细胞总RNA提取、反转录和Real-time PCR方法,鉴定胃癌细胞中let-7c的过表达效率和沉默效率以及检测hsacirc1483、PGC、SOX2、CDX2、TFF2 mRNA表达水平。同时,通过细胞蛋白提取、SDS-PAGE电泳、免疫印迹实验检测PGC、SOX2、CDX2、TFF2蛋白表达。5、Hsacirc1483与let-7c共同过表达胃癌细胞分化相关指标表达检测:将hsacirc1483过表达质粒和let-7c mimics同时瞬时转染至BGC823、AGS细胞系中,48h后收集细胞沉淀,与hsacirc1483单独过表达相比较,检测胃癌细胞PGC、SOX2、CDX2、TFF2 mRNA表达水平的变化。通过细胞蛋白提取、SDS-PAGE电泳、免疫印迹实验检测PGC、SOX2、CDX2、TFF2蛋白表达。6、统计分析:细胞中hsacirc1483、PGC、SOX2、CDX2、TFF2 mRNA及let-7c的相对表达量以2-△△ct表示,△△CT=（CT目的基因-CT内参基因）实验组-（CT目的基因-CT内参基因）对照组。采用Graphpad Prism 6进行统计分析和图形处理。以配对样本T检验比较两组的差异表达,所有数据均采用均数±标准差表示。研究结果:第一部分:Hsacirc1483在胃癌与癌旁组织的差异表达及其与胃黏膜分化基因PGC表达的相关性1、57对胃癌组织和癌旁组织检测结果发现hsacirc1483表达在胃癌及癌旁组织间存在显著差异。相对于胃癌旁正常组织(ANT 2-△CT1.53×10-5,(6.61×10-6,8.31×10-4)),胃癌组中hsacirc1483的表达显著降低(GC 2-△CT6.92×10-6,(3.17×10-6,1.90×10-4))（P<0.001）。2、为了进一步评估hsacirc1483在胃癌中的诊断效能,我们分析了ROC曲线下面积、敏感度及特异度。结果显示hsacirc1483区分胃癌组织和癌旁正常组织的ROC曲线下面积是65.19%（95%CI 0.55,0.75,P<0.001）,以7.20×10-6为cutoff值,敏感度50.90%,特异度75.4%。3、为了探讨hsacirc1483组织表达与PGC基因的相关性,我们利用Spearman’s correlation coefficient方法进行了相关性分析。结果表明在胃癌组织和癌旁正常组织中,hsacirc1483表达与胃黏膜分化基因PGC mRNA表达水平均呈显著正相关（胃癌组织:r=0.31,P=0.049,癌旁组织:r=0.38,P=0.01）第二部分:Hsacirc1483表达对胃癌细胞生物学行为的影响1、细胞筛选:通过Real-time PCR检测hsacirc1483在MGC803、HGC27、SGC7901、BGC823、AGS和MKN45三代胃癌细胞系中以及在正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达量,筛选出hsacirc1483相对低表达的胃癌细胞系HGC27和中等程度表达的细胞系BGC823、AGS。2、Hsacirc1483过表达效率:在BGC823、HGC27、AGS细胞系中,hsacirc1483过表达质粒的转染效率均高于50%。BGC823细胞系中hsacirc1483质粒的过表达效率是对照组的25000倍（P<0.05）,HGC27细胞系中,hsacirc1483质粒的过表达效率是对照组的1200倍（P<0.05）。AGS细胞系中,hsacirc1483质粒的过表达效率是对照组的20571倍（P<0.01）。3、Hsacirc1483过表达对细胞增殖能力的影响:在BGC823细胞系中分别转染hsacirc1483过表达质粒和对照质粒,,观察两组细胞的增殖能力。结果发现与对照组相比,hsacirc1483过表达组的胃癌细胞的增殖能力无明显变化,两组无统计学差异（P>0.05）。4、过表达hsacirc1483对胃癌细胞分化指标表达的影响（1）BGC823细胞系过表达hsacirc1483,PGC mRNA表达为1.52±0.14,SOX2 mRNA表达为1.90±0.23,均较对照组（mRNA表达设为单位1）显著升高（P<0.05）,TFF2 mRNA表达为0.82±0.03,较对照组显著降低（P<0.05）,未检测到CDX2转录水平的表达。BGC823细胞系转染hsacirc1483过表达质粒后,过表达组中TFF2蛋白表达的灰度值为0.09±0.08,较对照组（灰度值0.12±0.09）显著降低（P<0.05）,未检测到PGC、SOX2、CDX2蛋白表达。（2）HGC27细胞系过表达hsacirc1483后,PGC mRNA表达为1.36±0.12,较对照组显著升高（P<0.05）。（3）AGS细胞系转染hsacirc1483过表达质粒后,PGC蛋白表达的灰度值为0.47±0.01,较对照组（灰度值0.21±0.01）显著升高（P<0.001）;CDX2蛋白表达的灰度值为0.13±0.04,较对照组（灰度值0.29±0.08）显著降低（P<0.05）,TFF2蛋白表达的灰度值为0.04±0.01,较对照组（灰度值0.19±0.04）显著降低（P<0.05）。第三部分Hsacirc1483靶向结合let-7c参与胃癌细胞分化调控的分子机制研究1、双荧光素酶报告实验:与对照组（circRNA-nc+let-7c,荧光素酶活性设定为单位1）相比,野生质粒hsacirc1483+let-7c共转染,质粒的荧光素酶活性显著降低（hsacirc1483+let-7c vs circRNA-nc+let-7c:0.6 vs1,P<0.05）;突变质粒hsacirc1483-mut+let-7c共转染,质粒的荧光素酶活性无明显变化（hsacirc1483-mut+let-7c vs circRNA-nc+let-7c:1.05 vs 1,P>0.05）;野生质粒hsacirc1483+let-7c-NC共转染、突变质粒hsacirc1483-mut+let-7c-NC共转染,两组质粒的荧光素酶活性均无明显变化（hsacirc1483+let-7c-NC vs circRNA-nc+let-7c:1.08 vs1,hsacirc1483-mut+let-7c-NC vs circRNA-nc+let-7c:1.08 vs1,P>0.05）。双荧光素酶实验结果表明let-7c可以通过与hsacirc1483 3’-UTR靶向结合,抑制其荧光素酶活性。2、胃癌细胞中hsacirc1483与let-7c的调控关系（1）细胞筛选:通过Real-time PCR检测let-7c在MGC803、HGC27、SGC7901、BGC823、AGS和MKN45胃癌细胞系中以及在正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达量,筛选出三株胃癌细胞系:let-7c相对高表达的细胞系HGC27;中等程度表达的细胞系AGS、BGC823。（2）let-7c过表达及沉默效率:在BGC823、AGS细胞系中转染let-7c mimics,BGC823、HGC27细胞系中转染let-7c inhibitors,6h后观察转染效率,48h检测过表达或沉默效率。结果显示,BGC823细胞系中,let-7c过表达效率是对照组的130倍（P<0.05）。AGS细胞系中,let-7c过表达效率是对照组的460倍（P<0.05）。BGC823和HGC27细胞系中沉默let-7c后,其表达分别较对照组降低31%（0.56±0.18 vs 1,P<0.05）、10%（0.87±0.08 vs 1,P>0.05）。（3）过表达let-7c后,BGC823细胞系hsacirc1483表达为0.23±0.18,较对照组（设定为单位1）显著降低（p<0.05）;AGS细胞系中,hsacirc1483表达较对照组显著降低（0.54±0.40 vs 1,P<0.05）。沉默let-7c后,BGC823细胞系hsacirc1483表达显著升高（1.78±0.38 vs 1,P<0.05）,HGC27细胞系hsacirc1483表达亦显著升高（1.71±0.36 vs 1,P<0.05）。（4）过表达hsacirc1483后,BGC823细胞系中,let-7c表达为0.88±0.02,较对照组显著降低（P<0.05）。HGC27过表达hsacirc1483,let-7c表达为0.72±0.08,较对照组显著降低（P<0.05）。3、let-7c对胃癌细胞分化指标表达水平的影响（1）BGC823细胞系过表达let-7c,PGC mRNA表达为0.49±0.05,较对照组显著降低（P<0.01）,TFF2 mRNA为1.75±0.13,较对照组显著升高（P<0.05）;SOX2 mRNA为0.71±0.03,较对照组显著降低（P<0.05）,未检测到CDX2 mRNA表达。BGC823细胞系过表达let-7c后,TFF2蛋白表达的灰度值为0.44±0.06,较对照组（灰度值为0.25±0.15）显著升高（P<0.05）,未检测到PGC、SOX2、CDX2蛋白表达。（2）AGS细胞系过表达let-7c,PGC mRNA表达为0.87±0.05,较对照组显著降低（P<0.05）。沉默let-7c后,BGC823细胞系PGC mRNA表达为2.40±1.58,较对照组呈升高趋势（P>0.05）;HGC27细胞系中PGC mRNA表达为1.73±0.53,较对照组呈升高趋势（P>0.05）。AGS细胞系过表达let-7c后,PGC蛋白表达的灰度值为0.02±0.00,较对照组（灰度值为0.07±0.01）显著降低（P<0.05）,CDX2、TFF2蛋白表达的灰度值分别为0.84±0.04、0.60±0.06,均较对照组（CDX2灰度值为0.30±0.06,TFF2灰度值为0.17±0.01）明显升高（P<0.05）。4、共同过表达hsacirc1483和let-7c对胃癌细胞分化指标表达的影响（1）BGC823细胞系中,hsacirc1483和let-7c同时过表达后,PGC、SOX2mRNA水平（PGC:0.68±0.05,P<0.01;SOX2:0.37±0.06）较对照组（hsacirc1483单独过表达,设定为单位1）时均显著降低（P<0.01）,TFF2 mRNA水平（1.37±0.01）较hsacirc1483单独过表达时显著升高（P<0.001）。BGC823细胞系中,hsacirc1483和let-7c同时过表达后,TFF2蛋白表达灰度值为0.58±0.23,较hsacirc1483单独过表达（灰度值为0.45±0.18）明显升高（P<0.05）。（2）AGS细胞系中,hsacirc1483和let-7c同时过表达后,PGC蛋白表达的灰度值为0.27±0.02,较hsacirc1483单独过表达（0.47±0.01）明显降低（P<0.05）,CDX2、TFF2蛋白表达的灰度值分别为0.60±0.01,0.34±0.00,较hsacirc1483单独过表达（CDX2灰度值为0.13±0.04,TFF2灰度值为0.04±0.01）明显升高（P<0.01）。结论:1、Hsacirc1483在胃癌组织中表达显著降低,对于区分胃癌具有较高的诊断效能。2、Hsacirc1483的组织表达与PGC mRNA表达水平呈显著正相关。3、Hsacirc1483过表达对胃癌细胞增殖能力无明显影响。4、Hsacirc1483能够靶向结合let-7c,二者存在负向调控关系。5、Hsacirc1483可通过靶向结合let-7c,上调PGC mRNA和蛋白表达,上调SOX2 mRNA表达,下调CDX2蛋白表达,下调TFF2 mRNA和蛋白表达,参与胃癌细胞分化调控。