论文部分内容阅读
目的:肿瘤治疗对人类来说依然是巨大的挑战。相对于直接清除或杀伤肿瘤细胞的手术、化疗和放疗等传统的治疗方式,通过激活机体自身的免疫系统来杀伤肿瘤细胞的免疫疗法开启了新的时代。其中,应用免疫检查点抑制剂PD-1单抗和CTLA-4单抗解除肿瘤免疫耐受进而激活机体的免疫系统已是一种常规的肿瘤免疫治疗手段,而且将两者联合使用在多种肿瘤治疗中可以产生叠加或协同效应。相比将两者分别给药,设计将两个免疫检查点抑制剂均同时作用于同一个细胞,观察能否产生更大的协同抗肿瘤免疫效应。本研究以两亲性高分子材料PLGA-S-S-PEG为自组装基元,嵌入阳离子脂质DOTAP制备纳米颗粒递送载体,在颗粒表面负载CTLA-4 Aptamer和PD-1 siRNA构建还原响应性杂化球形核苷酸纳米体系,并探索CTLA-4和PD-1两免疫检查点抑制剂联合作用于同一个细胞是否产生更强的免疫协同作用及可能的作用机制。方法:首先合成两亲性高分子PLGA-S-S-PEG并对其进行表征,包括凝胶渗透色谱(GPC)测合成产物的分子量,DTT测氧化还原性。之后采用薄膜水化超声法制备PLGA-S-S-PEG/DOTAP纳米颗粒(PDN),通过静电吸附作用结合PD-1 siRNA与CTLA-4 Aptamer,并对制备的载药纳米颗粒进行表征,包括粒径、Zeta电位、形态、载药量及稳定性。体外观察T细胞对CTLA-4 Aptamer和PD-1 siRNA的摄取量以及它们对T细胞的增殖作用。体内建立小鼠MC38结肠癌肿瘤模型,给药后通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中的TNF-α等细胞因子的含量;采用流式细胞仪检测外周血、脾脏、肿瘤侧淋巴结、肿瘤局部CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞的比例变化及对CD4 Teff/Treg和CD8 Teff/Treg的影响;并最终通过监测肿瘤体积和肿瘤重量观察药物对小鼠肿瘤的抑制效果。结果:成功合成了两亲性高分子PLGA-S-S-PEG,并以此为基元制备了负载CTLA-4 Aptamer和PD-1 siRNA的杂化球形核苷酸纳米颗粒。纳米颗粒的表征结果显示空白纳米颗粒PDN的粒径为76.03±6.2 nm,Zeta电位为39.8±0.4 mV,载药纳米颗粒PDNp、PDNc、PDNpc 的粒径分别为 136.1 ±7.0 nm、149.5±5.4 nm、166.3±5.8 nm,Zeta 电位分别为 23.8±0.8 mV、22.4±0.6 mV,21.6±0.4 mV。所制得的纳米粒粒径均一,稳定性良好,TEM显示纳米粒呈相对均匀的球形结构。体外实验证实该纳米颗粒有效地促进了 T细胞对siRNA的摄取,纳米颗粒表面负载CTLA-4 Aptamer可增加T细胞对siRNA的摄取量;T细胞增殖实验显示纳米载体负载CTLA-4 Aptamer和/或PD-1 siRNA后,可显著促进T细胞的增殖,两者联用的促T细胞增殖效果强于单独一种抑制剂的效果,且两者负载于同一个纳米球上作用于同一细胞后产生的T细胞增殖强度,高于两者分别负载于不同纳米球上联合应用产生的增殖效果。体内实验进一步证实:载药纳米粒组的肿瘤体积和重量明显小于PBS组,两检查点抑制剂联用的抑瘤效果增强,且两者负载于同一个纳米球作用于同一细胞后产生的抑瘤效果好于负载于不同纳米球联合治疗产生的抑瘤效果;进一步的流式结果证实:在提高外周血、脾脏、肿瘤侧淋巴结和肿瘤浸润CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞所占比例及提高CD4 Teff/Treg和CD8 Teff/Treg 比值方面,两检查点抑制剂联用都优于PD-1 siRNA和CTLA-4 Aptamer单药治疗组,并且两者负载在同一杂化球形核苷酸纳米颗粒产生的作用显著优于两检查点抑制剂分别给药联合治疗组;血清中细胞因子TNF-α的分泌水平也显示相似的趋势。结论:成功制备 了负载 PD-1 siRNA 和 CTLA-4 Aptamer 的 PLGA-S-S-PEG/DOTAP杂化球形核苷酸纳米颗粒。该纳米颗粒在体外可显著刺激T细胞的增殖。将其通过尾静脉注入小鼠体内后,进一步证实该纳米颗粒可强烈刺激小鼠外周血、脾脏、肿瘤侧淋巴结以及肿瘤组织CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的增殖,产生强抗肿瘤效应。进一步的机制实验分析,引起该协同效应产生的至少部分原因是由于该纳米颗粒在CTLA-4 Aptamer介导下可靶向进入调节性T细胞(Treg),同时阻断CTLA-4和PD-1抑制途径,引起级联瀑布反应,大大减弱Treg的免疫抑制作用,进而产生协同抗肿瘤免疫反应。