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从韩国东海岸的蝾螺(Turbinidae batillus cornutus)肠道中筛选出的菌株YKW-34,能够有效降解一些褐藻和红藻的细胞壁多糖。通过分析其16S rRNA基因序列,将该菌株鉴定为Agarivorans albus,命名为Agarivorans albus YKW-34 (中文名暂定为白色琼胶贪食菌YKW-34)。A. albus YKW-34在其生长培养基marine broth中不产生多糖降解酶;但在以多糖作为碳源的培养基中可产生1种褐藻胶裂解酶和2种琼胶酶。本研究旨在对A. albus YKW-34产生的褐藻胶裂解酶和琼胶酶进行生产优化、分离纯化、性质研究及基因克隆,以便为两种酶的工业化应用提供理论依据和实践基础。通过单因子和正交实验,对A. albus YKW-34产褐藻胶裂解酶的培养条件进行了优化。结果表明,其最适碳源为海带粉0.5% (w/v),氮源为KNO3 0.1% (w/v),最佳种龄为12h,接种量为10%,最适培养基初始pH值为8.0,培养温度为25°C。在上述条件下,110rpm震荡培养48h,褐藻胶裂解酶产量达到最大值5U/ml。在发酵培养基中添加过量的多糖或单糖可抑制产酶;增加氮源的浓度或种类有利于菌株的生长,但也会抑制产酶。通过聚醚酰亚胺沉淀,阴离子交换、疏水及凝胶过滤色谱,进行了A. albus YKW-34产褐藻胶裂解酶的纯化。其回收率为7%,纯化倍数为25倍。SDS-PAGE和凝胶过滤色谱表明此酶由单一肽链组成,分子量为60kDa。等电聚焦实验表明其等电点为5.5-5.7。此酶的最适pH为7.0,在pH 7.0?10.0稳定;最适温度为30?40°C,低于50°C时稳定。此酶具有钠/钾离子依赖性。透析除去反应体系中钠/钾离子后,酶活力丧失;添加钠/钾离子后,酶活力可完全恢复。此酶对还原剂如β-巯基乙醇和DTT、金属离子络合剂如EDTA和EGTA具有耐受性;变性剂如SDS和尿素可使酶活力提高30%。底物专一性实验表明,此酶能同时降解甘露糖醛酸和古罗糖醛酸片断。通过单因子实验、Plackett-Burman设计及响应面设计实验,对A. albus YKW-34发酵产琼胶酶的条件进行了优化。单因子实验表明,最佳碳源和氮源分别为琼胶和酵母浸膏,最适培养温度为25°C。在此条件下,确定最适培养时间为12h。Plackett-Burman设计表明琼胶、酵母浸膏及初始pH三个因素对琼胶酶产量具有显著影响(P<0.05)。响应面设计实验确定此三个因素的最适水平为:琼胶0.23%,酵母浸膏0.27%,初始pH为7.81。经优化后,琼胶酶产量由0.23U/ml提高至0.87U/ml。用活性染色法对琼胶酶进行了原位测定,结果表明,琼胶酶为培养液中的主要蛋白质组分,其分子量约为50kDa。离子交换色谱表明,A. albus YKW-34能产生两种琼胶酶,将其分别命名为AgaA34和AgaB34,其中AgaA34产量为747U/l,AgaB34产量为83U/l。AgaA34进一步通过凝胶过滤色谱得以纯化。SDS-PAGE和凝胶过滤色谱表明此酶由单一肽链组成,分子量为50kDa。纯化的回收率为7%,纯化倍数为25倍。经测定,AgaA34的N端氨基酸序列为ASLVTSFEEA,与糖基水解酶家族50的琼胶酶相似;AgaB34的N端氨基酸序列为ADWDNIPIPAELDAG,与糖基水解酶家族16的琼胶酶相似。AgaA34的酶学性质分析表明,此酶的最适pH为8.0,在pH 6.0-11.0稳定;最适温度为40°C,在温度≤50°C时稳定。MALDI-TOF MS和13C NMR分析表明AgaA34的琼胶酶解产物为75mol%新琼二糖和25mol%新琼四糖。薄层色谱表明此酶能将新琼四糖降解为新琼二糖。以琼脂糖和新琼四糖为底物,此酶的催化效率分别为4.04×103和8.1×102s–1M–1。海水中的常见金属离子对AgaA34的酶活力无显著影响。此酶对SDS和尿素具有耐受作用;β-巯基乙醇和DTT可提高酶活力。本研究建立了A. albus YKW-34的基因组文库,并从此文库中克隆出琼胶酶基因(agaB34)。此基因长1362bp,编码453个氨基酸。根据同源性分析,判断其氨基酸序列1-23aa为信号肽,25-297aa为糖基水解酶家族16催化组件,316-452aa为碳水化合物结合组件。成熟蛋白的分子量预测为48,637Da,等电点预测为6.34。通过构建N端包含信号肽序列及C端镶嵌6个组氨酸的琼胶酶重组质粒,以大肠杆菌DH5α为宿主对该酶进行了重组表达。结果表明,重组琼胶酶(rAgaB34)可分泌至胞外,最高产量为1670U/l。rAgaB34可经亲和色谱进行一步纯化,回收率为80%,纯化倍数为15倍。rAgaB34分子量为49kDa,其终产物为新琼四糖。其结构域及终产物表明其属于糖基水解酶家族16成员。此酶的最适pH为7.0,在pH 5.0-9.0稳定;最适温度为30°C,在温度≤50°C时稳定。以琼脂糖为底物,此酶的比活力和催化效率分别为242U/mg和1.7×106s–1M–1。此酶对EDTA和EGTA、SDS和尿素及β-巯基乙醇和DTT具有耐受性。