论文部分内容阅读
正常附植前胚胎的发育需要经过受精卵的多次分裂、胚胎基因组的活化等重要阶段。附植前胚胎是胚胎发育分化的关键,研究胚胎在不同发育阶段mRNA表达模式,便于了解胚胎正常发育的重要信息。在相关研究报道的基础上,本研究通过建立单个胚胎mRNA差异显示技术,并利用该技术对体外培养的奶牛早期胚胎发育基因的表达以及卵巢在有无黄体情况下卵母细胞差异表达基因进行研究,了解奶牛体外培养的早期胚胎在特定发育阶段及卵母细胞基因特异表达的模式,对于阐明胚胎发育的内在机制,分析影响卵母细胞发育潜能的因素具有重要意义。1.单胚DDRT-PCR方法的建立选取体外培养的4细胞期胚胎,用酸性台氏液除去透明带,胚胎裂解液裂解胚胎,以单胚和多胚mRNA作模板,用锚定引物和随机引物进行RT-PCR扩增,用持家基因GAPDH特异引物扩增作对照,分别用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳比较单胚与多胚扩增结果,结果表明,单胚能够取得与多胚同样的效果,从单胚扩增的GAPDH与预期的一致,因此建立了的单胚DDRT-PCR方法是有效的。2.黄体对卵母细胞差异表达基因的影响为了研究卵巢在有无黄体状态下卵母细胞基因表达的情况,从兰州屠宰场采集奶牛的卵巢,分离卵母细胞,以单个卵母细胞的mRNA作为模板,用随机引物和锚定引物、一步法RT-PCR扩增卵母细胞基因,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有黄体和无黄体卵巢卵母细胞表达基因,发现电泳条带之间无明显差异,选择唯一条差异条带回收、纯化PCR产物连接到T载体,阳性克隆鉴定后,进行测序,同源性比较分析,与体外培养的牛早期胚胎的一条序列具有很高的同源性。3.奶牛早期胚胎基因表达的研究选取体外培养的奶牛2～16细胞期胚胎,以单胚mRNA作模板,进行RT-PCR扩增,扩增产物凝胶电泳检测,在胚胎基因组激活期间有8条选择差异条带,回收、转化、克隆,对阳性克隆进行测序,用Blast软件进行同源性检索,E1与Oct-4mRNA同源,E2与类似于牛细胞周期蛋白激酶调节亚基1同源,E3与牛THAP结构域9同源,E4与鼠胚胎NbME13.5、14.5同源,E5与牛高迁移率族蛋白同源,E6与鼠10日龄胚胎cDNA同源、E7与类似于牛11染色体开放阅读框同源,E8与牛Sec61γ亚单位同源。这些基因与细胞增殖、分化,细胞周期调节有关,在早期胚胎发育中发挥重要作用。