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常用阿片类药物及曲马多、氯诺昔康、氯胺酮、丙泊酚对成年人Th0细胞分化的影响——体外实验研究
研究背景早在许多年前，围术期的感染和长时间麻醉后的骨髓抑制现象就引起人们对麻醉手术病人机体免疫系统功能的关注。虽然组织创伤及手术的严重应激反应被认为是免疫抑制的主要原因，但是麻醉及镇痛药物对机体免疫功能的影响亦不能低估。部分文献显示，某些镇痛药可以抑制机体的免疫功能。Th0细胞是一重要的免疫活性细胞，它向Th1或Th2方向分化的比例，影响机体免疫功能。虽然已知吗啡可使Th0细胞向Th2方向分化，然而许多镇痛药物尤其是新近使用的镇痛与镇静药物对Th0细胞的影响尚不得而知，且其分子生物学机制尚不十分清楚。
目的从Th0细胞分化的角度比较常用阿片类镇痛药物、曲马多、氯诺昔康、氯胺酮和丙泊酚对机体细胞免疫功能的影响，从免疫调控角度为选用合适镇痛药物以及适宜浓度提供参考依据，并探讨部分机制。
方法采集健康成年人的外周静脉血，肝素钠抗凝，采用随机区组设计，分批检测实验药物对Th0细胞分化的影响。参考临床血药浓度，每个药物分别设置低、中、高3个浓度梯度组，同时以0.9％NaCl溶液为空白对照。吗啡为10ng/ml(M1)，100ng/ml(M2)，1000ng/ml(M3)三组；芬太尼为0.2ng/ml(F1)，1.0ng/ml(F2)，10ng/ml(F3)三组；曲马多为50ng/ml(T1)，500ng/ml(T2)，5000ng/ml(T3)三组；氯诺昔康为150ng/ml(L1)，500ng/ml(L2)，1500ng/ml(L3)三组；舒芬太尼为0.05ng/ml(S1)、0.5ng/ml(S2)、5ng/ml(S3)三组；氯胺酮为100ng/ml(K1)、500ng/ml(K2)、2500ng/ml(K3)三组；丙泊酚为1μg/ml(P1)、4μg/ml(P2)、16μg/ml(P3)三组。同时为了排除丙泊酚制剂中脂肪溶剂影响，设脂肪乳剂对照组0.1μl/ml(I1)、0.4μl/ml(I2)、1.6μl/ml(I3)三个浓度组。
用三种不同方法从不同层面评估Th0细胞的功能分化情况并探讨部分机制：(1)胞内细胞因子检测：采用体外全血培养，加入药物、淋巴细胞刺激剂(PMA+离子霉素)及蛋白质转运抑制剂，培养4小时后，用流式细胞仪检测Th1或Th2细胞的百分率变化；(2)趋化因子受体(CCR5/CCR3)检测：采用外周血单个核细胞，经药物预处理24小时后，加入刺激剂PHA继续培养48h，用流式细胞仪检测Th1或Th2细胞的百分率变化。(3)采用ABC-ELISA法或CBA法检测PBMCs培养上清中Th1型(IFN-γ、IL-2、TNF-α)和Th2(IL-4、IL-6、IL-10)型细胞因子的含量。
所有数据以均数±标准差表示，统计分析采用SPSS11.0软件，组间比较采用随机区组设计方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果(一)胞内细胞因子检测：(1)与空白对照组相比，吗啡和芬太尼三个不同浓度组Th1亚群的比例显著降低(P＜0.05)，Th2亚群的比例显著升高(P＜0.05)，二者的比值(Th1/Th2)也显著降低(P＜0.05)；曲马多或氯诺昔康低浓度组的上述数值分别与空白对照组相比较无显著性差异(P＞0.05)，但两药的中浓度组和高浓度组的上述数值均发生类似吗啡或芬太尼的显著变化(P＜0.05)；吗啡、芬太尼、曲马多或氯诺昔康组同一药物内低、中、高三个浓度组之间比较，随着药物浓度的升高Th1亚群的比例显著降低(P＜0.05)，Th2亚群的比例明显升高(P＜0.05)；(2)与空白对照组相比，舒芬太尼和氯胺酮在低浓度时，Th1和Th2亚群比例及Th1/Th2比值差异均无统计学意义。舒芬太尼在中浓度及高浓度时，Th1亚群比例显著下降(P＜0.05)，Th2亚群比例明显升高(P＜0.05)，Th1/Th2比值下降(P＜0.05)。氯胺酮在中浓度及高浓度时Th1和Th2亚群比例虽呈下降趋势(P＜0.05；P＜0.05)；但高浓度组的Th1/Th2比值则明显升高(P＜0.05)。(3)与空白对照组比较，低、中浓度丙泊酚对Th1、Th2亚群比例和Th1/Th2比值作用均不明显；但高浓度丙泊酚可以使Th1亚群的比例、Th1/Th2比值显著升高(P＜0.05)；与空白对照组比较，低、中浓度脂肪乳剂对Th1、Th2亚群比例和Th1/Th2比值作用均不明显。而高浓度脂肪乳剂可以使Th1亚群的比例显著降低(P＜0.05)，但对Th1/Th2比值作用并不明显；丙泊酚低、中、高三个浓度组之间比较，高浓度组较低浓度组的Th1亚群比例及Th1/Th2比值显著升高(P＜0.05)。
(二)细胞膜表面趋化因子受体检测结果类似于胞内细胞因子检测：(1)与空白对照组比较，吗啡和芬太尼三个不同浓度组Th1亚群的比例均显著降低(P＜0.05)，而Th2亚群的比例均明显升高(P＜0.05)，两者的比值(Th1/Th2)均显著降低(P＜0.05)；曲马多与氯诺昔康各自的低浓度组分别与空白对照组相比较无显著性差异(P＞0.05)，但两药的中浓度组和高浓度组上述数值均呈现与吗啡芬太尼类似的显著变化(P＜0.05)；(2)舒芬太尼在中浓度和高浓度时，与空白对照组相比，Th1亚群的比例降低(P＜0.05)、Th2亚群的比例上升(P＜0.05)，Th1/Th2比值降低(P＜0.05)。经氯胺酮处理后，与空白对照组相比，中浓度和高浓度组的Th1和Th2亚群的比例均降低(P＜0.05；P＜0.05)，未发生向Th2分化的现象；各浓度组与空白对照组Th1/Th2的比值相比较无显著性差别。(3)与空白对照组比较，低、中浓度丙泊酚对Th1、Th2亚群的比例和Th1/Th2比值作用均不明显，但高浓度丙泊酚可以使Th1亚群的比例、Th1/Th2比值显著升高(P＜0.05)；与空白对照组比较，低、中浓度脂肪乳剂对Th1、Th2亚群的比例和Th1/Th2比值作用均不明显，但高浓度脂肪乳剂可以使Th1、Th2亚群的比例显著降低(P＜0.05)，但对Th1/Th2比值作用并不明显。丙泊酚低、中、高三个浓度组之间比较，高浓度组较低浓度组Th1亚群的比例显著升高(P＜0.05)。脂肪乳剂低、中、高三个浓度组之间比较，高浓度组较低浓度组Th1亚群的比例显著降低(P＜0.05)。
(三)培养上清液中特异性细胞因子检测：(1)与空白对照组比较，吗啡、芬太尼三个浓度组Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2)的浓度均显著降低(P＜0.05)，而Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)的浓度显著升高(P＜0.05)；曲马多、氯诺昔康低浓度组两型细胞因子的浓度无显著性改变(P＞0.05)，中、高浓度组IFN-γ和IL-2的浓度均显著降低(P＜0.05)，IL-4、IL-10的浓度均显著升高(P＜0.05)；吗啡、芬太尼、曲马多和氯诺昔康同一药物不同浓度组之间比较，细胞因子浓度均呈现明显的梯度变化，随着药物浓度的升高IFN-γ和IL-2的含量均显著降低(P＜0.05)，而IL-4、IL-10的含量显著升高(P＜0.05)。(2)舒芬太尼对Th1型细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2)有抑制作用，并呈剂量依赖性，对Th2型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)仅在高浓度组IL-4水平显著降低，其余等均未见显著差异。氯胺酮对Th1和Th2型细胞因子的分泌均有抑制作用，并随药物浓度的升高使上述细胞因子浓度均呈下降趋势。
结论在本研究的药物浓度条件下，三种不同的检测方法结果基本一致：(1)吗啡、芬太尼、舒芬太尼、曲马多和氯诺昔康均可以介导Th0细胞向Th2分化，但是以吗啡、芬太尼和舒芬太尼作用为强，曲马多和氯诺昔康此作用较弱，五种常用镇痛药物随着药物浓度的升高，介导Th0向Th2分化的作用均越来越明显，即药物浓度越高Th2细胞的比例越高，呈现明显的浓度依赖性；相关Th1和Th2型细胞因子的变化也呈现明显的浓度依赖性；(2)氯胺酮对Th1和Th2均有一定程度抑制作用，但以抑制Th2细胞分化作用更为明显，表现为Th1/Th2比值上升，相关的Th1和Th2型细胞因子的变化也呈现一致的改变并呈明显的浓度依赖性；(3)丙泊酚在高浓度组时可以介导Th0细胞向Th1方向分化，表现为Th1/Th2的比值上升；脂肪乳剂对于Th0细胞的分化没有明显影响。