论文部分内容阅读
目的:探讨miR-134在人骨肉瘤增殖和血管生成中的作用及其可能的作用机制,并从分子层面分析miR-134分子对骨肉瘤生物学性状的影响,为骨肉瘤临床早期诊断和分子靶向治疗提供理论依据和治疗靶点,为骨肉瘤治疗提供新思路。方法:(1)qRT-PCR检测miR-134在三株不同骨肉瘤细胞系(MG-63、U2-OS及Saos-2)和正常成骨细胞中RNA含量,并检测miR-134在人骨肉瘤组织和正常骨组织中含量,比较其表达差异。(2)在Saos-2和MG-63两株骨肉瘤细胞系中,利用过表达质粒转染,达到过表达miR-134表达量目的。对照组转染空白载体。体外实验检测过表达miR-134对骨肉瘤细胞增殖(细胞培养计数)、凋亡(流式细胞学法、Western-blot)、血管生成(HUVECs实验)等生物学特性的影响。(3)利用慢病毒载体转染Saos-2细胞,并构建骨肉瘤裸鼠动物模型,在体实验检测miR-134对骨肉瘤形成和血管生成的作用,并检测瘤体中miR-134和VEGFA/VEGFR1表达量。(4)qRT-PCR和Western-blot分别检测患者骨肉瘤组织及正常骨组织中VEGFA/VEGFR1的mRNA和蛋白水平表达情况,ELISA检测miR-134对靶基因VEGFA/VEGFR1表达影响。(5)荧光素酶报告基因技术验证miR-134的靶基因VEGFA/VEGFR1表达情况,并进一步经蛋白水平(Western-blot)验证。结果:(1)qRT-PCR结果显示miR-134在骨肉瘤细胞系和人骨肉瘤组织中均较正常成骨细胞(P<0.05)和骨组织中(P<0.0001)表达量明显降低。(2)利用慢病毒载体转染骨肉瘤细胞,转染效率可达90%以上,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达miR-134细胞株,并采用qRT-PCR验证表达量(P<0.0001)。体外水平结果显示,miR-134可抑制骨肉瘤细胞增殖(p<0.001)和血管生成(p<0.001),促进骨肉瘤细胞凋亡(P<0.05)。(3)体内实验结果显示,miR-134可抑制骨肉瘤形成和血管生成(p<0.001),并经FMT验证(P<0.001)。(4)骨肉瘤组织中VEGFA/VEGFR1的mRNA和蛋白水平均较正常骨组织升高,且ELISA结果提示miR-134可呈时间(p<0.001)、剂量依赖方式(P<0.0001)抑制VEGFA/VEGFR1的表达。(5)荧光素酶报告基因结果提示过表达miR-134可明显降低载有VEGFA和VEGFR1基因3’-UTR的荧光报告基因的荧光强度,同时Western-blot验证miR-134抑制AKT及PCNA活性。结论:(1)差异性表达的miR-134与骨肉瘤发生发展有着密切联系。(2)miR-134在体外水平可通过抑制骨肉瘤细胞增殖且促进凋亡而发挥抑癌作用。(3)miR-134在体内水平可抑制骨肉瘤形成和血管生成。(4)VEGFA和VEGFR1与骨肉瘤增殖和血管生成有密切联系,过表达miR-134可抑制VEGFA和VEGFR1的表达量。(5)VEGFA和VEGFR1是miR-134的靶基因,为miR-134抑制骨肉瘤增殖和血管生成机制提供依据。