独脚金内酯诱导VviBRCs基因参与葡萄夏芽萌发的调控机理解析

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hanyouzhu
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葡萄夏芽属早熟性芽,当年可多次萌发并形成副梢。这种情况不仅大量消耗树体养分,增加葡萄园夏季管理成本,且副梢抹除造成的伤口易导致病原菌入侵,对葡萄生长及品质产生不利影响。因此,探究影响葡萄夏芽萌发的生理因素和分子机制,对于应用人工手段调控葡萄夏芽萌发,从而降低葡萄生产成本具有重要意义。本研究以酿酒葡萄‘赤霞珠’(Vitis vinifera L.cv.Cabernet Sauvignon)的一年生盆栽苗为试材,经同等强度摘心处理,利用独脚金内酯(strigolactone,SL)的人工合成类似物Germination Releaser 24(GR24)对未萌发夏芽进行涂抹处理,从夏芽表型、激素水平、转录水平等不同层面展开深入对比分析,明晰GR24对葡萄夏芽萌发的影响及关键调控基因和代谢路径;针对SL信号转导过程中的关键转录因子—分枝基因(VviBRCs)及其启动子进行克隆、表达模式、亚细胞定位分析,并进行互作蛋白的筛选与鉴定及转基因功能验证,探讨SL诱导VviBRCs基因参与葡萄夏芽萌发调控的分子机理。研究结果可为葡萄育种领域提供丰富的基因数据资源,为抑制葡萄夏芽副梢、创制副梢量少的优良葡萄种质提供理论与技术支撑。主要结果如下:(1)GR24可在一定程度上抑制葡萄夏芽的萌发。摘心后,夏芽迅速萌发,增长速度较快;GR24处理后夏芽增长速率显著降低,且随着GR24浓度的升高,夏芽生长受抑制作用增强;其相邻位置冬芽的生长及其次年的萌发未见明显变化;GR24处理引起夏芽中激素水平发生变化,脱落酸(ABA)和生长素(IAA)含量的下降趋势变缓,细胞分裂素(ZR)和赤霉素(GA3)含量的增加幅度亦减小。(2)GR24抑制葡萄夏芽萌发过程的转录组测序分析。利用Illumina Hiseq-4000测序平台对GR24处理后0 d、1 d、3 d及5 d的葡萄夏芽进行转录组测序,以0 d的基因表达作为参照,筛选对照组和GR24处理组1 d、3 d及5 d的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),然后分别比较同一时期的DEGs,发现DEGs数量分别为6303、8891及10268个,其中在三个比较组合中均发生差异表达的基因有3221个;Gene Ontology(GO)富集分析发现,DEGs显著富集到转录因子活性、核糖体及细胞内核糖核蛋白复合物等功能;Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)可显著富集到光合—天线蛋白途径,在核糖体、内质网蛋白加工、植物激素信号转导、碳代谢及MAPK信号转导等途径也高度富集。信号转导和细胞活力相关的KEGG路径中,上调基因比例在GR24处理后显著降低,植物激素合成与信号转导途径中多个基因发生差异表达;另外,也鉴定出一些可响应GR24信号的转录因子,其中包括TCP转录因子家族的两个分枝基因(BRANCHED,BRC)。(3)葡萄分枝基因VviBRCs的克隆与表达分析。在葡萄基因组中鉴定出三个VviBRC基因,其开放阅读框分别为1377、1167和1131bp,编码458、388和376个氨基酸。通过实时定量PCR分析发现三者均在葡萄冬芽、夏芽、幼叶中表达量较高,随着夏芽萌发,三个基因表达量均呈降低趋势。摘心、细胞分裂素(6-BA)及GA3等引起夏芽萌发的处理均会使VviBRCs表达降低。(4)葡萄分枝基因VviBRCs启动子的克隆与表达分析。分别克隆三个分枝基因上游2.0 kb的序列,将其与β-D-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)报告基因连接,构建植物表达载体,转化拟南芥获得转基因纯合株系;通过GUS组织化学染色分析发现,三个分枝基因均是在幼苗生长发育较快的部位,如花托、根茎连接部、子叶、真叶的叶柄中高效表达;通过启动子活性分析发现GR24处理可提高GUS活性,黑暗处理可降低GUS活性,这与其启动子序列上包含相关的响应元件有密切关系。(5)葡萄分枝基因VviBRCs的亚细胞定位、转录活性分析及互作蛋白的筛选与鉴定。3个VviBRCs均为核定位蛋白,VviBRC1和VviBRC2无转录激活活性,而VviBRC3有转录激活活性,其激活区段位于C端177-376 aa。通过构建酵母双杂交c DNA文库,筛选获得较多候选蛋白,其中包括细胞周期、激素信号转导及核糖体相关蛋白,利用酵母双杂交回转实验初步证明VviBRC可与Sn RK1、Histone H4或SDA1进行互作。(6)葡萄分枝基因VviBRCs在拟南芥中的功能验证。构建了植物过表达载体,借助根癌农杆菌将其分别转入野生型和BRC1缺失突变型拟南芥中,通过观察和统计发现,过表达植株总分枝减少,且VviBRCs可使BRC1突变体的多分枝表型得到部分恢复,表明VviBRCs基因在调控腋芽萌发过程中功能保守。通过对转基因拟南芥中BRC1下游靶基因的表达进行实时定量PCR分析,发现ABA相关基因如ABF3、ABI5、HB21、HB40、HB50和NCED1的表达增加,而细胞分裂相关基因如Histone H4和CYCD3的表达降低。
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