人SCL基因重组腺病毒表达载体的构建

来源 :石河子大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Blue0220
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目的:构建含人SCL基因的pDC315-SCL重组腺病毒载体,为下一步研究SCL基因在ICC样细胞的功能奠定基础。方法:从含有人SCL基因的质粒中,采用PCR方法扩增SCL基因,将目的载体pDC315-EGFP进行酶切后交换,其产物转化细菌感受态细胞,对克隆产物进行菌落PCR鉴定,对阳性克隆产物进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的重组穿梭质粒。pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)El,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度。通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对Cajal样间质细胞的转染率。结果:PCR扩增的SCL基因片段长度为1036bp,测序结果以及重组质粒pDC315-EGFP-SCL阳性克隆凝胶电泳鉴定均证明SCL基因成功克隆到腺病毒穿梭质粒真核表达载体中。pDC315-SCL重组腺病毒载体通过PCR结果证明和Western Blot检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010PFU/mL,对膀胱Cajal样间质细胞的转染率可达95%。结论:成功构建了含人SCL基因真核表达载体pDC315-EGFP-SCL和应用AdMax载体系统成功构建含人SCL基因重组腺病毒载体pDC315-SCL。pDC315-SCL重组腺病毒载体对Cajal样间质细胞有很高的转染效率。
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