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贝类是水生态系统的初级消费者,在底栖动物中占优势。蓝藻水华产生的微囊藻毒素严重影响了贝类的生存,贝类可以通过直接的摄食活动将MC快速地富集在体内通过产生活性氧簇引起贝类机体氧化系统失衡,以致细胞损伤。选择性自噬和Keap1-Nrf2通路是主要的抗氧化应激途径,氧化剂可通过多条信号途径诱导细胞产生自噬和激活Keap1-Nrf2途径以缓解氧化损伤。Keap1-Nrf2的激活途径分为经典途径和非经典途径。在应激条件下,Keap1构象发生改变,以致Nrf2入核与小Maf形成异源二聚体,诱导Nrf2靶标调控区的抗氧化酶功能,从而保护细胞和组织免受氧化损伤,这是Keap1-Nrf2激活的经典途径。P62是选择性自噬衔接蛋白,通过与泛素蛋白结合穿梭至蛋白酶体或溶酶体,参与泛素-蛋白酶体和自噬溶酶体的蛋白质降解,其表达水平通常与自噬成反比。哺乳动物p62在氧化应激中充当协调自噬和Keap1-Nrf2信号通路的细胞整合点,通过形成p62/Keap1-Nrf2正反馈回路介导细胞自噬上调抗氧化反应元件ARE抗氧化酶和解毒酶来保护细胞免受损伤,此途径被称为Keap1-Nrf2激活的非经典途径。本文以暴露在MC环境下的褶纹冠蚌为研究对象,对褶纹冠蚌p62进行鉴定与功能分析,阐明p62与自噬的关联,以及p62与Keap1-Nrf2通路的调控关系,探讨贝类p62/Keap1-Nrf2途径消减贝类微囊藻毒素引起的应激反应。1、Western Blot、免疫组化及qRT-PCR实验发现MC胁迫蚌24 h,Cp Nrf2蛋白的表达和mRNA转录水平显著增强,Cp Nrf2敲降后,在MC诱导24 h其mRNA和蛋白表达均显著降低;CpKeap1a敲降后MC诱导96 h,Cp Nrf2 mRNA和蛋白表达显著增强。MC促进GOT、GPT及相关抗氧化酶活显著上调,进而通过激活抗氧化酶减轻蚌的肝胰腺受损。荧光素酶报告基因实验表明Cp Nrf2以剂量依赖性促进Cp NQO1基因启动子的活性上调;在细胞毒性承受范围内,MC以剂量依赖性上调Cp NQO1基因启动子的活性,并且MC促进Cp Nrf2上调Cp NQO1基因启动子的活性。2、构建pGEX 4T-1-CpKeap1a、pET30a-Keap1b和pET-32a-Nrf2表达载体,诱导蛋白表达,纯化GST-CpKeap1a和HIS-Cp Keap1b蛋白,其浓度分别为0.338mg/m L和0.22 mg/m L。GST-pulldown结果表明CpKeap1a与Cp Keap1b形成异源二聚体。构建FLag-CpKeap1a、FLag-Cp Keap1b、HA-CpKeap1a、HA-Cp Keap1b、HA-Cp Nrf2、FLag-Cp Nrf2等表达载体,免疫共沉淀显示CpKeap1a与Cp Keap1b可以形成同源和异源二聚体,Cp Nrf2可以与CpKeap1a和Cp Keap1b相互结合。3、从构建的褶纹冠蚌血细胞转录组文库中筛选p62、LC3、Bcl-2基因片段,克隆了Cpp62、CpLC3和CpBcl-2基因的c NDA序列全长。Cpp62 c DNA全长序列为2484 bp,其5’UTR序列为88 bp,3’UTR序列为1247 bp,ORF序列为1149 bp,编码382个氨基酸,其中包含高度保守的p62-PB1结构域（3-90aa）、ZZ链结构域（102-148）和UBA结构域,预测有LIR结构域而无KIR结构域。该蛋白含有一个poly（A）尾,质谱测定其分子量为42.485 k Da,理论等电点（PI）为5.98。CpLC3 c DNA序列全长为2151 bp,其5’UTR序列为64 bp,3’UTR序列为1721 bp,ORF框长度为366 bp,其编码121个氨基酸,包含一个高度保守Ub1＿ATG8＿MAP1LC3结构域。该蛋白含有一个poly（A）尾,其蛋白质分子量为14.10 k Da,PI为9.39。CpBcl-2 c DNA序列全长为760 bp,其5’UTR为93 bp,3’UTR为132 bp,ORF序列为535 bp,共编码177个氨基酸,其中包含高度保守的Bcl-2样superfamily结构域（44-145aa）,其分子量为20.17 k Da,PI为6.61。4、MC胁迫后,肝胰腺中Cpp62 mRNA的表达在24和48h明显上调,其在肾脏中的表达也均上调;CpKeap1a敲降后,MC促进肝胰腺中Cpp62在24,48和72 h的表达上调,促进肾脏Cpp62在72和96 h表达上调;Cp Nrf2敲降后,MC促进肝胰腺中Cpp62的表达在24、48和72h下调。Western Blot实验结果显示MC促进Cpp62的蛋白表达,褶纹冠蚌Keap1-Nrf2途径正向调控Cpp62蛋白的表达,与荧光定量PCR结果一致。结果表明MC可以激活褶纹冠蚌Keap1-Nrf2途径参与调控Cpp62 mRNA和蛋白的表达。5、克隆褶纹冠蚌p62基因启动子,分析其含有Nrf2、Maf G、Mafk和Nrf2-Maf G二聚体结合元件,并含有4个ARE元件。EMSA表明Cp Nrf2蛋白阻滞Cpp62-ARE迁移,荧光素酶报告基因显示Cp Nrf2以剂量依赖性促进Cpp62-ARE活性上调。但是MC抑制Cp Nrf2上调Cpp62启动子活性。Cpp62启动子ARE元件突变后,其活性被Cp Nrf2转录因子抑制。6、合成褶纹冠蚌p62双链干扰序列（Cpp62-ds RNA）,Cpp62-ds RNA干扰效率在24和48 h分别为64.7%和58.6%,表明Cpp62-ds RNA具有干扰效率,且Cp Nrf2和Cp NQO1的表达在Cpp62-ds RNA处理组显著下调。荧光素酶报告基因实验发现Cpp62可以呈Cp Nrf2浓度依赖性促进Cp NQO1和Cpp62基因启动子的活性上调。但是,MC抑制Cpp62促进Cpp62启动子的活性上调,且Cpp62抑制ARE元件突变的Cpp62启动子活性。7、Cpp62与CpKeap1a体外不形成二聚体,双荧光素酶报告显示CpKeap1a和Cp Keap1b均不影响Cpp62促进Cp NQO1和Cpp62基因启动子的活性。8、构建自噬抑制剂和自噬激活剂贝类模型,采用qRT-PCR和Western Blot检测发现自噬的动态变化影响了Cpp62的表达;TEM观察MC诱导褶纹冠蚌产生轻度自噬,并且发现Cpp62-ds RNA中自噬溶酶体数量减少,自噬小体消失,表明褶纹冠蚌Cpp62可能介导自噬小体的形成,且贝类存在Cpp62依赖型自噬。9、CpLC3在检测的组织中均有表达,自噬激活剂诱发蚌产生自噬时上调CpLC3的表达,并且MC引起的氧化应激促进CpLC3 mRNA的表达水平显著上调;免疫双荧光定位发现MC促进CpLC3蛋白分别与Cpp62、CpKeap1a蛋白在细胞中发生重叠;免疫共沉淀实验表明CpLC3分别与CpKeap1a、Cp Keap1b和Cpp62结合。结果表明蚌发生自噬和氧化应激均影响CpLC3基因的转录,并促进蚌内p62-Keap1a-LC3聚合体的形成。10、qRT-PCR检测发现自噬缺陷时,CpBcl-2 mRNA的表达水平呈显著性下降;反之,自噬发生时其表达相反。Tunel结果显示3-MA促进细胞发生凋亡,Rap抑制细胞凋亡,并且Cpp62-ds RNA组织中的凋亡细胞数量高于对照组。结果表明MC诱发蚌产生的细胞自噬可以抑制细胞凋亡,揭示褶纹冠蚌p62可以正向调控细胞凋亡。