目的:特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF）是一种慢性、致死性纤维化肺病,其发病机制不明确,目前尚缺乏有效的治疗手段。环状RNA（circular RNA,circRNA）是近年来新发现的一种非编码RNA,已被证明在多种疾病的发生发展中起重要的调控作用,但其在IPF进展中的作用仍不清楚。本研究旨在揭示IPF患者外周静脉血中环状RNA的差异性表达谱,筛选差异明显的环状RNA,并进一步在细胞实验及动物活体中探讨其功能及可能的分子机制,从而为IPF的诊断和治疗提供新的靶点。方法:1.根据诊断标准收集年龄大于65岁的IPF患者的外周静脉血样本6例和健康志愿者血液样本4例,通过高通量全转录组测序技术检测外周血的环状RNA,通过生物信息学技术分析差异表达的环状RNA。同前入选标准,再次收集IPF患者和健康对照组外周血样本各20例,通过RT-qPCR方法对筛选出的差异表达明显的环状RNA进行验证。2.选择MRC-5和IMR-90两个人肺成纤维细胞系进行细胞实验。用RT-qPCR方法验证hsa_circ₀006508在细胞中的表达。通过Sanger测序验证hsa_circ₀006508的环状序列。利用生物信息学技术,预测hsa_circ₀006508调控的miRNA及其下游靶蛋白。应用细胞诱导和转染技术,模拟IPF细胞环境,敲减hsa_circ₀006508的表达。将两细胞系均分为空白对照组,TGF-β1组（TGF-β1诱导）,TGF-β1+si-NC组（TGF-β1诱导,阴性siRNA转染）,TGF-β1+si-Circ组（TGF-β1诱导,siRNA转染）。MTT实验检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。RT-qPCR方法检测各组细胞hsa_circ₀006508、miR-520a-5p的表达。双荧光素酶实验验证hsa_circ₀006508对miR-520a-5p,以及miR-520a-5p对TLR7的调控作用。Western blot方法检测各组细胞I型胶原和TLR7蛋白的表达。3.选择9周龄健康雄性的C57BL/6小鼠,博莱霉素诱导构建肺纤维化小鼠模型。将小鼠分为:NC14组（对照组14天取材）、NC28组（对照组28天取材）、IPF14组（博来霉素造模14天取材）、IPF28组（博来霉素造模28天取材）。通过HE染色观察小鼠肺组织结构,Masson染色观察小鼠肺组织纤维化程度。RT-qPCR方法检测小鼠肺组织hsa_circ₀006508同源基因的表达。Western blot方法检测小鼠肺组织I型胶原和TLR7蛋白的表达。结果:1.人外周静脉血中共鉴定出7869个差异表达的环状RNA转录本,其中377个环状RNA在两组间的差异性表达有统计学意义（fold change>2.0,P<0.05）。与正常对照组比较,IPF组中有286个环状RNA表达上调,91个环状RNA表达下调;64个环状RNA首次被发现。GO分析提示差异表达的环状RNA可能参与了组蛋白甲基化、2型免疫反应负调控、CCR4-NOT复合物的形成、MHC蛋白复合物的形成、poly（A）特异性核糖核酸酶活性调节、SUMO结合等生物功能;KEGG分析显示其可能参与了内质网蛋白加工、TNF、ErbB、FoxO等信号通路的调节。通过预测差异表达环状RNA调控的前5位miRNA。筛选差异表达明显的5个上调的环状RNA进行扩大样本量RT-qPCR验证,其中hsa_circ₀007334,hsa_circ₀001395,hsa_circ₀000972和hsa_circ₀006508的表达量IPF组明显高于对照组,与高通量测序结果一致。2.在MRC-5和IMR-90两个人肺成纤维细胞系中检测上述4个环状RNA的表达,hsa_circ₀006508的表达丰度最高。经Sanger测序证实hsa_circ₀006508的环状结构。经RT-qPCR检测,在TGF-β1诱导的细胞中hsa_circ₀006508的表达显著增加,转染si-Circ可有效减少hsa_circ₀006508的表达。细胞外基质I型胶原在TGF-β1诱导组含量明显增加,TGF-β1+si-Circ组表达量明显减少（P<0.05）。MTT和细胞划痕实验显示TGF-β1诱导可促进肺成纤维细胞的增殖和迁移,而hsa_circ₀006508的敲减能显著抑制TGF-β1的诱导效应。生物信息学预测hsa_circ₀006508可吸附miR-520a-5p,调控其下游TLR7的表达。RT-qPCR检测结果示TGF-β1组miR-520a-5p含量较对照组明显减少（P<0.01）,与TGF-β1+si-NC组比较,TGF-β1+si-Circ组miR-520a-5p含量显著上调（P<0.01）。双荧光素酶实验验证了hsa_circ₀006508可作为miR-520a-5p海绵,吸附miR-520a-5p,且hsa-miR-520a-5p能与TLR7mRNA3’-UTR直接结合。Western blot结果示TGF-β1组TLR7蛋白含量较对照组明显增加（P<0.01）;与TGF-β1+si-NC组比较,敲减hsa_circ₀006508后,TLR7蛋白含量显著降低（P<0.05）。3.小鼠肺组织HE和Masson染色结果示,肺纤维化的早期阶段,肺组织炎症反应明显,有大量炎细胞浸润;后期阶段,肺泡结构破坏明显,可见大量成纤维细胞增殖聚集和细胞外基质基质沉积。同源性分析显示mmu_circ₀003507是hsa_circ₀006508在小鼠中的同源基因。RT-qPCR检测结果示,博来霉素诱导的小鼠肺组织中mmu_circ₀003507的表达量明显上调,且随病情的进展及纤维化程度的加重而增加,IPF28组明显高于IPF14组（P<0.05）。Western blot结果示IPF组I型胶原及TLR7的表达量明显高于对照组（P<0.05）,且IPF28组高于IPF14组。结论:1.本研究揭示了IPF患者外周静脉血环状RNA的差异表达谱,并预测了其潜在的作用,进一步丰富了环状RNA数据库。2.扩大样本量验证证实,IPF患者外周血中hsa_circ₀007334,hsa_circ₀001395,hsa_circ₀000972和hsa_circ₀006508 4个环状RNA的表达量显著上调。3.在体外细胞实验中,hsa_circ₀006508在TGF-β1诱导肺纤维化细胞模型中表达上调,通过吸附miR-520a-5p,上调其下游靶蛋白TLR7的表达,从而促进肺成纤维细胞的增殖、迁移和细胞外基质的沉积,在IPF中发挥促纤维化作用。提出hsa_circ₀006508/miR-520a-5p/TLR7通路可能是IPF的一种新的发病机制。4.在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中,mmu_circ₀003507（hsa_circ₀006508在小鼠中的同源基因）的促纤维化作用贯穿于整个肺纤维化发生发展的阶段,其表达量与疾病的严重程度及发展进度密切相关。为hsa_circ₀006508成为新的IPF临床诊断标记物及治疗靶点提供了理论的可能性。