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乳酸是21世纪最具发展潜力的有机酸之一,L-乳酸以其具有的独特构型优势展示了广泛的应用前景。随着石油资源的枯竭和新型环保材料——聚乳酸需求量的日益增加,人们正在努力寻找替代石油燃料的新能源和降低L-乳酸生产成本的新原料。包括林木、农作物秸秆及农副产品下脚料等在内的植物纤维原料是地球上产量最大的可再生资源,在自然生态系统的能量流与物质循环中占有重要的地位。本文以植物纤维水解主要成分——葡萄糖和木糖为原料,通过N+注入诱变和定向选育筛选L-乳酸高产突变株,采用响应面法优化摇瓶发酵条件,初步探究高产突变株利用五、六碳糖共发酵产L-乳酸的发酵机理,建立菌体生长和产物生成动力学模型。主要结论如下:
1)经不同剂量的N+注入后,菌株的存活率曲线呈典型的“马鞍型”;综合考虑注入剂量对菌株存活率与突变率的影响,在离子能量为15 KeV时,N+注入该米根霉菌株的最佳诱变剂量为50×2.5×1013ions/cm2。
2)采用最佳注入剂量筛选,最终得到一株产酸性能优良且遗传特征稳定的突变株N50-7,该菌株以葡萄糖、木糖为碳源,发酵72h的L-乳酸产量为79.46 g/L,较同批发酵的原始菌株的发酵周期缩短了36 h,L-乳酸产量提高了18.02％。
3)在单因素试验的基础上,结合响应面法优化获得突变株N50-7发酵产L.乳酸的培养基组成和培养条件。最佳发酵条件为:葡萄糖100 g/L,木糖50 g/L,(NH4)2SO43.0 g/L,KH2PO40.3 g/L,MgSO4·7H2O0.3 g/L,ZnSO4·7H2O0.4 g/L,摇床转速180 r/min,温度32℃,接种量12％,装液量50 mL,该条件下发酵72 h,L-乳酸产量可达119.178 g/L,。
4)发酵过程中的酶活变化结果表明,乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、木糖还原酶和木糖醇脱氢酶为米根霉菌株利用葡萄糖、木糖共发酵产L-乳酸的关键酶。突变株N50-7的乳酸脱氢酶、木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的比活力均高于原始菌株,而乙醇脱氢酶的比活力低于原始菌株。对高产突变株和原始菌株的蛋白点进行双向电泳匹配,获得了22个差异蛋白点。
5)选择Logistic和Luedeking-Piret非线性模型对高产突变株发酵产L-乳酸过程中的菌体生长及产物生成进行动力学分析,运用Matlab软件对试验数据进行拟合,建立起动力学模型。
菌体生长动力学模型:dX/dt=0.1632(1-X/6.28)X产物生成动力学模型:dP/dt=14.2143dX/dt+0.1153X经验证试验表明,模型能够较好地反映L-乳酸产生菌生长及产物合成的动力学行为。