固有免疫是机体免疫系统防御微生物感染的第一道防线。激活固有免疫需要模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别微生物病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)后，在机体内形成相应信号转导，最终引起免疫应答。YIPF5是YIP家族蛋白成员之一，定位于内质网、ERGIC、顺面高尔基体上。研究表明YIP家族蛋白成员能与Rab GTPase结合，参与调节内质网与高尔基之间的囊泡运输。作为YIP家族蛋白中的一员，YIPF5与内质网上COPⅡ被膜小泡的生成过程有关，可以随COPⅡ小泡由内质网转移至顺面高尔基体上。STING是调控Ⅰ型干扰素基因表达的重要信号分子，在感受胞质DNA和免疫防御方面起着重要的信号传递作用，研究表明STING所介导的信号通路的活化依赖于它在细胞内的转位，当机体感染DNA病毒后，STING从内质网经过高尔基体转移至核外周小体上，进而活化下游信号通路，促进Ⅰ型干扰素的产生。YIPF5参与了胞内囊泡运输，并且影响从内质网到高尔基体的转运过程，但YIPF5是否参与机体的天然免疫反应以及STING的转位仍然未知。因此本论文探索了YIPF5是否通过影响STING功能进而调控天然免疫抗病毒反应。在本文中，发现用siRNA干扰小鼠腹腔巨噬细胞中YIPF5的表达后，ISD、LPS、SeV诱导的Ⅰ型干扰素IFN-β和炎性细胞因子TNF-α、IL-6等表达下调，干扰素调节因子IRF3和激酶TBK1的磷酸化都明显下调;在感染VSV病毒后，巨噬细胞的抗病毒能力同样下降。同时YIPF5影响STING在核周的聚集，说明YIPF5可能通过影响STING的转位调节机体天然免疫反应。　　研究目的:　　探讨YIPF5在抗病毒天然免疫中的作用，YIPF5是否通过STING影向天然免疫信号通路。　　研究方法:　　1)敲低YIPF5的表达是否影响天然免疫信号通路中不同细胞因子的表达　　获得小鼠原代腹腔巨噬细胞，转染YIPF5siRNA48h后，分别转染ISD3h、6h、9h;LPS刺激2h、4h、6h;感染SeV4h、8h、12h，提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA后，用qRT-PCR在mRNA水平上检测不同信号通路下游细胞因子IFN-β，TNF-α，IL-6，Ccl5和Cxcll0在mRNA水平表达的变化。　　2)敲低YIPF5的表达是否影响天然免疫信号通路中IRF3和TBK1磷酸化　　获得原代小鼠腹腔巨噬细胞，向巨噬细胞中转染siYIPF5为实验组，同时以siCtrl做对照组。48h后转染ISD1h、2h、4h;LPS刺激0.5h、lh、2h;感染SeV2h、4h、6h，提取细胞总蛋白，用Western Blot在蛋白水平上检测IRF3和TBK1磷酸化水平的变化。　　3)敲低YIPF5的表达是否影响巨噬细胞抗病毒能力　　获得原代小鼠腹腔巨噬细胞，转染siYIPF5，同时以siCtrl做对照组。用VSV-GFP感染4h、8h、12h，保留细胞上清培养液，用试剂盒提取细胞总RNA，反转录为cDNA后，用qRT-PCR在mRNA水平上检测IFN-β、VSVmRNA的表达;收集细胞培养液上清，在HEK293细胞中用病毒空斑实验检测病毒滴度;转染siRNA敲低巨噬细胞中YIPF5的表达，用VSV-GFP感染4h、6h，提取细胞总蛋白，检测细胞内VSV-G在蛋白水平的变化。　　4)YIPF5是否影响STING的聚集　　获得小鼠原代腹腔巨噬细胞，转染siRNA敲低巨噬细胞中YIPF5的表达后，转染ISD刺激细胞内STING发生转位，使STING活化聚集成大的复合物，通过免疫荧光染色在荧光显微镜下观察STING的聚集状态。　　构建YIPF5过表达载体，在Hela细胞中过表达YIPF5，以Vector为对照，同时转染STING-GFP，在荧光显微镜下观察STING-GFP的表达是否受影响。　　在Hela细胞中转染siCtrl或siYIPF524小时后，转染STING-GFP，24小时后在荧光显微镜下观察STING-GFP在核周的聚集状态。　　5)YIPF5是否与STING相互作用　　在Hela细胞中过表达STING-Myc，同时梯度过表达YIPF5-Myc，用Western Blot检测STING和STING-Myc在蛋白水平上的表达变化。　　在Hela细胞中过表达YIPF5，以Vector为对照，同时转染STING-GFP，24h后转染ISD激活STING使其转位发生二聚化，免疫荧光染色YIPF5，在荧光显微镜下观察STING与YIPF5是否存在共定位现象。　　获得原代小鼠腹腔巨噬细胞，转染ISD2h、4h后，用免疫共沉淀检测内源性YIPF5和STING的是否直接结合。　　研究结果:　　1)敲低YIPF5的表达下调天然免疫信号通路中多种细胞因子的表达　　在小鼠原代腹腔巨噬细胞中用小干扰RNA敲低YIPF5的表达后，转染ISD或感染LPS/SeV，激活细胞内多条免疫信号通路，用qRT-PCR检测多种下游细胞因子在mRNA水平的变化，发现敲低YIPF5的表达后，细胞内IFN-βmRNA水平表达下降，IFN-β相关基因Ccl5和Cxcl10在mRNA水平上表达下降;促炎因子TNF-α，IL-6mRNA水平表达下降。　　2)敲低YIPF5的表达下调天然免疫信号通路中IRF-3和TBK1磷酸化水平　　转染siRNA敲低巨噬细胞中YIPF5的表达，转染ISD或用LPS、SeV感染不同时间段之后，Western Blot检测结果显示转录因子IRF3、激酶TBK1在蛋白磷酸化水平均有明显下降趋势。　　3)敲低YIPF5的表达使巨噬细胞抗病毒能力减弱　　用VSV验证了YIPF5的抗病毒作用，发现敲低YIPF5表达后，VSV感染小鼠巨噬细胞引起细胞内IFN-βmRNA表达下降，而VSV mRNA水平表达上升，同时病毒空斑实验也发现YIPF5表达下降使VSV病毒滴度升高;VSV-G在蛋白水平表达上升。　　4)YIPF5影响STING的聚集　　在转染siRNA敲低小鼠原代腹腔巨噬细胞中YIPF5的表达后，转染ISD使STING活化，发生转位和聚集，然后对STING进行免疫荧光染色，在显微镜下观察STING的表达和聚集情况，发现在不给予ISD刺激时，实验组荧光强度相较于对照组较弱;在ISD激活STING后，实验组荧光强度相较于对照组则明显减弱;　　在Hela细胞中共转染STING-GFP和YIPF5-Myc，同时转染Vector做阴性对照，24h后收细胞做免疫荧光染色，发现过表达YIPF5对STING的聚集现象没有明显增强作用。　　在Hela细胞中转染siCtrl或siYIPF524小时后，转染STING-GFP，24小时后在荧光显微镜下观察STING-GFP在核周的聚集状态，发现对照组STING-GFP明显在核周聚集，而实验组相对分散。　　5)YIPF5与STING没有直接结合　　在Hela细胞中转染STING-GFP，同时梯度共转染YIPF5-Myc，24h后Western Blot检测发现细胞内STING和STING-Myc在蛋白水平没有明显变化。　　在Hela细胞中共转染STING-GFP和YIPF-Myc，24h后转染ISD使STING活化聚集，4h后收细胞做免疫荧光染色。在荧光显微镜下观察后，发现STING和YIPF5没有共定位现象。　　同时在小鼠原代腹腔巨噬细胞中转染ISD使STING活化，收细胞蛋白，用Co-IP检测STING与YIPF5在巨噬细胞内是否存在内源性结合，结果显示二者也没有直接结合。　　研究结论：　　1)YIPF5在抗病毒天然免疫中发挥作用，敲低YIPF5的表达影响IRF3和激酶TBK1的磷酸化，进而影响免疫应答下游多种细胞因子的表达。　　2)敲低YIPF5的表达会影响STING转位聚集，但YIPF5不影响STING的表达，而且YIPF5与STING没有直接相互作用。YIPF5调控STING转位的精确调控机制还需要进一步研究。