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猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以成年母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要特征的高度接触性传染病,该病已成为危害全球养猪业的主要疫病之一。尽管目前预防该病的灭活疫苗和弱毒疫苗已经研制出来,但应用于实际生产中,其安全性和有效性等方面都存在着很多质疑,并且免疫效果不佳,因此研发基因工程疫苗防制猪繁殖与呼吸综合征势在必行。同时近年来的研究表明,PRRSV流行毒株存在广泛的变异现象,同一基因型的分离毒株之间存在明显的序列差异,特别是在基因组ORF1a的Nsp1B和Nsp2、ORF3和ORF5的变异性很大,由此可见,了解PRRSV的基因变异对于基因工程疫苗的研究有重要的参考价值。本研究参考GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株(PRRSVGuizhou-1,基因编号EU259060)核苷酸序列,设计一对特异性引物,将实验室分离保存的猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株(PRRSV Guizhou-1)接种于Marc-145细胞,待细胞出现典型的细胞病变(CPE)后,收集细胞悬液,用Trizol试剂提取总RNA并进行RT-PCR反应。反应条件为:42℃30min RT反应;94℃2min,94℃30 s,55℃30s,72℃1min,35个循环,最后72℃10min,结果获得大小约750bp的目的DNA条带,与预期大小相符。回收纯化扩增的目的DNA条带后,将其连接于质粒pMD18-T载体后,转入大肠杆菌Top10细胞中,提取阳性质粒DNA并酶切鉴定后,将目的DNA分别克隆于原核表达载体pET32a(+)和真核表达载体pcDNA3.1(+)中,并分别转入感受态细胞BL21和Top10中,通过抗性筛选、酶切鉴定和序列测定证明原核表达载体和真核表达载体构建成功,该研究为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株(Guizhou-1)ORF5基因的体外表达、开发新型诊断试剂盒和新型疫苗奠定了基础。PRRSV贵州株ORF5基因变异的研究是通过采集2007年贵州省16家规模化养殖场153份疑似PRRS猪临床材料,分别采用金标卡、ELISA和RT-PCR进行检测,结果为金标卡抗体检测阳性病料64份,ELISA抗体检测阳性病料54份,RT-PCR阳性病料28份。测序结果分析表明:所有RT-PCR阳性病料ORF5基因核苷酸序列的同源性为98.7%～100%,氨基酸序列同源性为98.5%～100%,与美洲型代表毒株VR-2332、国内标准毒株CH-1a和欧洲型代表毒株LV基因核苷酸序列的同源性分别为89.2%～90%、94.8%～95.6%、59.7%～60.2%,氨基酸序列同源性分别为88.8%～89.3%、92.7%～94.2%、54.9%～55.3%。遗传衍化关系分析表明贵州流行毒株属于美洲型,ORF5基因发生离散性变异可以分为三个簇(Ⅱ簇,Ⅲ簇,Ⅵ簇),与我国其他地区分离高致病性PRRS病毒关系密切,而与早期分离的PRRS毒株关系疏远,结果表明贵州省猪繁殖与呼吸综合征病毒基因存在变异现象,该实验结果将为贵州省猪繁殖与呼吸综合征的防控体系的建立及基因工程疫苗的研究提供重要的参考依据。