复方双丹活性组分筛选及骨髓间充质干细胞培养研究

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心血管疾病是目前导致人类死亡的主要疾病之一。中药双丹方(丹参、丹皮)在治疗心血管疾病方面有独特的疗效。骨髓间充质干细胞(BMMSCs)具有多分化潜能,可定向分化为心肌细胞,且没有来源的伦理问题,这为BMMSCs移植治疗心脏病提供了广阔的前景。但中药是个复杂的化学物质体系,双丹方成分复杂,有效成分难以阐明。幼年大鼠骨髓比较少,大鼠BMMSCs的分离纯化比较困难。 本论文循活性指导的药物先导化合物筛选思想,复制大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型,模拟缺血再灌注损伤。以乳酸脱氢酶(LDH)活性为检测指标,对双丹方51个组分进行活性筛选。研究发现丹参3个组分对心肌细胞缺氧复氧损伤有保护作用,其中2个组分为脂溶性成分,1个组分为水溶性成分。丹皮有6个组分对心肌细胞缺氧复氧损伤有保护作用,其中4个组分为脂溶性成分,2个组分为水溶性成分。这9个有效组分主要成分为丹参醛类、丹参酮类、丹参醇类以及醌类物质。 本论文成功地进行了大鼠BMMSCs的分离纯化与培养。用Percoll分离液采用密度梯度离心法,对BMMSCs进行分离;采用差速贴壁法对BMMSCs进行纯化。采用流式细胞术与激光共聚焦法对纯化的细胞()CD类表面抗原进行鉴定,其中CD29、CD44、CD105、CD166表达呈阳性,而CD14、CD34、CD45表达呈阴性,这与BMMSCs的表面抗原表达情况相符。采用RT-PCR方法鉴定了三个干细胞标志基因,其中nestin和NST为高表达基因,而Oct-4为弱表达基因。以上结果共同证明,我们从大鼠骨髓中分离纯化出来的贴壁细胞为BMMSCs。这种快速简便实用的分离纯化BMMSCs方法可为细胞与组织工程提供种子细胞,对基础研究及临床应用有重要意义。
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