同源异形域-亮氨酸拉链(HD-ZIP)是一类植物特有的转录因子家族,在植物的非生物胁迫响应以及形态建成中发挥重要的调控作用,其中HD-ZIP I亚家族主要与植物抵抗非生物胁迫相关。苜蓿被誉为牧草之王,是国际上畜牧业生产中最重要的优质饲用牧草,具有产量高、营养价值高、环境适应性较强等优点。蒺藜苜蓿是苜蓿研究中的模式植物,因其为二倍体、基因组较小、生长周期短、种子产量高、易于遗传转化等特点,非常适合作为实验研究对象。目前关于蒺藜苜蓿中HD-ZIP基因家族分析及抗逆功能方面的报道较少。本文主要从全基因组水平对蒺藜苜蓿中HD-ZIP基因家族进行了系统的生物信息学分析,利用数据库中的基因芯片数据对其在不同组织、以及干旱和盐胁迫下的表达模式进行分析。并针对HD-ZIP I亚家族中Mt HDZ35与Mt HDZ50基因,对其在干旱和盐碱非生物胁迫响应中的功能进行深入研究。首先,通过生物信息学的手段,在蒺藜苜蓿中鉴定出52个HD-ZIP(Mt HDZ1-Mt HDZ52)基因。通过Mt HDZ蛋白全长序列构建邻位相连法(Neighbor-Joining)进化树,将Mt HDZ蛋白划分为I-IV四个亚家族。对Mt HDZ的基因结构和蛋白的保守基序分析表明I与II亚家族结构较为简单,III与IV亚家族结构较为复杂,各亚家族之间基因结构及保守基序具有高度一致性。通过Phytozome中Mt HDZ基因的注释信息将51个Mt HDZ基因定位在8条染色体上,18个基因(9个旁系同源基因对)位于染色体重复大片段上,表明苜蓿HD-ZIP家族的扩增主要与染色体片段重复有关。旁系同源基因对的非同义替代率与同义替代率的比值(Ka/KS)介于0.096-0.502,表明纯化选择(purifying selection)在蒺藜苜蓿HD-ZIP基因家族的进化中起主要作用,旁系同源基因分化时间约为47.53至90.98百万年前。利用PLACE在线工具,分析Mt HDZ I与II亚家族启动子中的顺式作用元件,发现其中大多数顺式作用元件与光照响应相关,I亚家族中鉴定出多个与干旱胁迫有关的顺式作用元件,II亚家族中更多鉴定出极端温度相关的顺式作用元件。利用蒺藜苜蓿基因表达谱网站(Mt GEA)的基因芯片数据,对苜蓿HD-ZIP基因在不同发育阶段的组织和器官,以及干旱或盐胁迫处理的幼苗中的表达模式进行分析,结果表明,大多数Mt HDZ基因在不同组织中均有表达,另一些基因具有组织特异性表达模式。在不同生长阶段受到盐胁迫处理后,20个Mt HDZ基因表现出显著升高或抑制的表达模式,14个Mt HDZ基因在干旱胁迫下的地上部分与地下部分中表现出不同的升高或降低的表达模式。此外,许多旁系同源基因的在不同组织以及干旱、盐碱下的表达模式不尽相同,表明其功能或许已产生了分化。为验证基因芯片结果的可靠性,选取了9个Mt HDZ I家族基因,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)研究了其在盐胁迫处理下的表达模式,结果显示盐处理下9个Mt HDZ I家族基因的表达情况与表达谱分析结果基本一致。接下来我们对拟南芥中响应干旱等胁迫的At HB13的直系同源基因Mt HDZ35和Mt HDZ50在非生物胁迫响应中的功能进行了研究。酵母单杂交试验结果表明Mt HDZ35和Mt HDZ50均具有转录激活能力,且其转录激活域均位于多肽链C端。通过q RT-PCR分析了Mt HDZ35和Mt HDZ50基因在干旱胁迫以及ABA处理下的表达情况,表明在干旱胁迫下Mt HDZ50与Mt HDZ35表达量显著上升,在ABA处理下Mt HDZ35表达量显著下降,Mt HDZ50表达量显著上升。构建了两个基因的过量表达载体并通过农杆菌介导转化拟南芥进行功能分析,已获得Mt HDZ50过表达的纯合转化株。分析了Mt HDZ50过表达株系在ABA响应、盐胁迫、模拟干旱胁迫下的萌发率和根伸长情况,结果表明Mt HDZ50过表达株系在种子萌发过程对外源ABA响应敏感性降低,对模拟干旱处理和Na Cl盐胁迫的耐受性显著增强。本研究加深了我们对蒺藜苜蓿中HD-ZIP在抵抗非生物胁迫方面作用的认识,鉴定出了一批干旱和盐碱胁迫响应的后续基因,这将有助于今后进一步深入揭示苜蓿HD-ZIP基因在响应非生物胁迫途径的功能及其分子机制,并最终通过基因工程手段提高苜蓿的抗逆性。