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目的中国的“糖肾时代”已经到来,据统计,中国已有近5亿人处于糖尿病前期,每10个人中就有一个糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者,其中近40%的患者可以发展为糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease,DKD）。而在肾脏病透析登记系统的数据显示,DM已经超越肾小球肾炎成为新增透析病因谱的首位因素。由糖尿病引发的社会经济负担已成为全球重大公共卫生问题值得深入探究。近年来,随着研究的不断深入,不断涌现出一批具有心、肾保护作用的降糖药物,如钠-葡萄糖共转运蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2）抑制剂,虽然达到了很好的降糖效果,能够在一定程度上延缓肾脏进展,但仍然会引起肾脏糖异生增加、渗透性利尿等副作用。这就提示我们还需进一步探索糖尿病肾病的发病机制,寻找新的治疗靶标。现阶段观点认为,糖尿病是有“代谢记忆”的即使控制好血糖水平,但是肾脏进展的风险始终存在。新药如胰高糖素样肽-1受体激动剂（利拉鲁肽等）、减重代谢手术等均是基于减肥调控能量代谢为主发挥控糖作用。因此,人们逐渐转变治疗理念,从“以血糖为中心的治疗模式”转向“以血脂为中心的治疗”。新观点认为,下丘脑能量代谢的神经-内分泌机制调节外周器官蛋白质-能量-脂质代谢紊乱介导了糖尿病的发生发展。蛋白质-能量-脂质代谢紊乱,不仅表现为以血脂谱升高为主的肥胖状态,还有另一个极端表现就是分解代谢亢进,引起蛋白质能量耗竭状态,甚至进展为恶病质。肥胖和蛋白质能量消耗（protein energy wasting,PEW）均属于下丘脑能量代谢调控紊乱的结果。肾脏不仅是排泄器官,也是重要的能量代谢器官。但是,除肾脏交感神经活化外,下丘脑是否调控肾脏的能量代谢及神经回路尚不清楚。机体血浆渗透压升高引起下丘脑室旁核和视上核加压素（Vasopressin,又名抗利尿激素）的分泌,进一步靶向肾脏集合管参与水代谢平衡调节。新研究发现,Vasopressin参与2型糖尿病肝脏脂肪变性的过程,抗衰老蛋白Klohto在糖脂代谢和维持能量平衡中发挥重要作用。课题组前期动物模型研究发现在DM向DKD进展的早期,肾脏组织存在明显的脂质沉积现象,提示脂毒性参与DKD肾脏进展。因此,本项目意旨探讨2型糖尿病肾病患者蛋白质-能量-脂质代谢紊乱、血浆渗透压与肾脏进展的关系,进而从从神经-内分泌调控肾脏代谢的新角度,积极探索下丘脑Klotho/Vasopressin介导DKD肾脏异位脂肪沉积的可能作用机制及中枢干预靶点,为防止T2DM向DKD发展,阻止其向终末期肾病进展提供强有力的宏观理论依据,已成为肾脏病研究领域的创新项目。方法1.蛋白质-能量-脂质代谢紊乱与2型糖尿病肾病患者肾脏进展相关性研究1.1选取糖尿病肾病非透析期患者1219例收集患者一般信息、血常规、肾功能、血脂谱、电解质、肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate,e GFR）及尿微量白蛋白、尿肌酐数据,并计算获得尿白蛋白肌酐比（Urinary albumin-creatinine ratio,UACR）、残余胆固醇（Remnant cholesterol,RC）、血浆渗透压（osmotic pressure,Os P）,采用线性回归及逻辑回归分析血脂谱与UACR、e GFR、Os P升高的关系。1.2选取终末透析期患者774例应用生物阻抗评估患者的静息代谢率（resting metabolic rate,RMR）和人体成分（体细胞量和脂肪量）。采用标准测量方法收集人体测量数据,并计算上臂肌围（arm muscle circumference,AMC）,通过三日饮食日记计算每日蛋白及能量摄入。获得生化、营养和透析参数。随机收集204例患者血清用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测Klotho/成纤维生长因子（fibroblast growth factor,FGFs）水平,采用线性回归及逻辑回归分析RMR、Klotho/FGFs与糖尿病及PEW之间的关系。2.T2DN大鼠肾脏异位脂肪沉积与下丘脑Klotho/Vasopressin的相关性分析以链脲菌素（streptozocin,STZ）诱导T2DN大鼠4w、8w、12w、16w为研究对象,免疫组化分别检测肾脏脂肪沉积分子水通道蛋白7（aquaporin 7,AQP7）、脂肪细胞分化相关蛋白（adipocyte differentiation-related protein,ADRP）、血小板反应蛋白受体（thrombospondin receptor,CD36）,下丘脑Klotho/FGF23的表达趋势;根据分子表达趋势峰值确认肾脏脂质代谢研究在病程12w时最明显,收集12w T2DN大鼠摄食、饮水、尿蛋白等数据,用R语言“corrr”包进行相关性分析。3.中枢给予重组Klotho对db/db小鼠肾脏脂质组学和代谢组学的影响选取12周龄db/db小鼠为研究对象,单次侧脑室分别注射重组Klotho、达格列净以及二者联合用药作用3天后,收集肾脏组织标本进行色谱/质谱分析,通过原始数据分析,偏最小二乘法判别分析建立预测模型,以校正P值（错误发现率,FDR）＜0.25、变量重要性投影（VIP）＞1筛选差异脂质及代谢物,用R包ggplot2绘制火山图,使用R包多尺度嵌入基因共表达网络分析联合cytoscape（3.6.0）构建多尺度代谢物共表达网络。4.中枢重组Klotho下调db/db小鼠下丘脑Vasopressin改善肾脏异位脂质沉积中枢重组Klotho干预db/db小鼠,收集每日体重、摄食、饮水、血糖、尿蛋白肌酐比等指标的变化情况,免疫组化检测下丘脑Vasopressin、Klotho/FGFR1、SGLT2的变化;免疫组化检测肾脏AQP7、ADRP、Klotho、SGLT2的变化。体外实验,应用下丘脑神经内分泌细胞（GT1-7）及FGFR受体抑制剂PD173074、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）抑制剂wortmannin和Janus激酶/信号转导与转录激活子（The Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions,JAK/STAT）抑制剂tofacitinib干预细胞后,免疫荧光检测Vasopressin的表达;ELISA法检测血清、细胞上清Vasopressin、Klotho、白细胞介素-6（IL-6）的水平。5.Vasopressin致肾小管上皮细胞异位脂质沉积的机制研究选取小鼠近端肾小管上皮细胞（mouse proximal renal tubular epithelial cells,MPTEC）为研究对象,0.2m M棕榈酸（palmitic acid,PA）造模,外源性给予10-6M Vasopressin,A-769662和Balovaptan。油红O染色检测MPTEC细胞内脂滴沉积情况,并检测细胞内甘油三酯水平,q-PCR定量AQP7 m RNA水平,Western Blot检测AQP7、ADRP、腺苷酸激活蛋白激酶（adenylate activates the protein kinase,AMPK）/胰岛素诱导基因2（Insulin-inducible gene 2,INSIG2）、加压素受体（vasopressin receptor,AVPRs）蛋白表达,免疫荧光检测AQP7膜易位变化情况。结果1.糖尿病进展至糖尿病肾病患者占比达48.89%,明显高于前期研究报道的40%;RC水平升高与T2DN非透析期患者出现大量蛋白尿（UACR＞300mg/g）的风险增加有关;而RC水平降低与T2DN非透析期患者Os P升高有关;RMR水平减低与透析患者合并PEW风险增加有关;Klotho而不是FGFs能够预测透析患者同时合并DM及PEW的过程。2.在T2DN组大鼠肾脏中AQP7、ADRP和CD36的表达水平在8w至12w时差异具有统计学意义（P＜0.05）;肾脏脂质代谢分子在造模4w-16w之间存在峰值,且ADRP的达峰时间在12w,较AQP7和CD36的达峰时间滞后。T2DN大鼠下丘脑Vasopressin表达升高,且与RC、促进脂质沉积的相关因子（AQP7、ADRP、CD36、SREBP-1C）呈正相关,与ACC呈负相关;T2DN大鼠下丘脑和肾脏Klotho表达减少,且与Vasopressin、RC、促进脂质沉积的相关因子呈负相关,与ACC呈正相关。3.与假手术组相比,侧脑室注射重组Klotho肾脏脂质组学中磷脂酰胆碱[PC（16:1/18:3）]上调,磷脂酰乙醇胺[PE（18:1/18:3）]上调、鞘磷脂[SM（d14:3/30:1）]下调,双半乳糖甘油二酯[DGDG（16:0/16:0）]下调（FDR＜0.05,VIP＞1）。在非靶代谢组学中,未发现侧脑室注射重组Klotho干预的差异化合物。4.中枢给予重组Klotho能够降低肾脏组织AQP7、ADRP、AVPR1A蛋白表达,Dapa中枢注射还能够诱导db/db小鼠肾脏Klotho蛋白的表达,但是对尿蛋白肌酐比值无影响。与假手术组相比,Klotho组能够减少db/db小鼠摄食和饮水,明显降低空腹血糖与随机血糖。下丘脑免疫组化染色显示Klotho组Vasopressin表达明显下调,并且血清copeptin水平也被Klotho降低。体外实验发现,重组Klotho可能通过FGFR1/PI3K和JAK/STAT通路,抑制下丘脑神经内分泌细胞GT1-7细胞Vasopressin的表达与分泌。5.为了进一步明确Vasopressin在肾脏是如何参与脂质异位沉积,在PA诱导MPTEC细胞中外源性加入10-6M Vasopressin促进细胞脂滴增多和甘油三酯水平进一步升高。Vasopressin促进MPTEC细胞脂质沉积的作用是通过与AVPR1A结合,去磷酸化AMPK/INSIG2通路,上调AQP7膜易位及ADRP脂滴形成蛋白介导。结论Klotho能够预测2型糖尿病肾病患者肾脏进展及蛋白质能量消耗状态。中枢补充Klotho通过FGFR1/PI3K和JAK/STAT通路下调Vasopressin能够改善肾脏异位脂肪沉积,进而Vasopressin靶向肾脏与AVPR1A结合通过AMPK/INSIG2通路加剧肾脏异位脂肪沉积;