研究背景和研究目的结肠癌在在人类常见的癌症中的被诊断率已经跃居第三位。在癌症的治疗中,除了局部切除治疗外,化疗仍然是一个普遍并有效的方式。许多联合给药的治疗方案中,化疗药物都具有一定的毒副作用。筛选新型小分子化合物抑制肿瘤细胞生长并且研究其具体机制仍然是研究中的热点。并且通过化学遗传学的方法研究细胞程序性死亡和细胞周期的具体机制能够为促进药物开发,为肿瘤治疗打下理论基础。细胞程序性死亡可以被分为三大类,凋亡是其中的一个重要类型,在多细胞生物的正常发育和稳态保持中有着关键的调控作用。凋亡是去除不需要的、衰老的和受损的细胞的重要机制,凋亡的失调会导致多种疾病,其中包括癌症的发展。自噬是另一类重要的细胞程序性死亡,在正常条件下可以通过降解多余的细胞器和细胞内错误折叠的蛋白等,来提供营养用以维持细胞正常的生命活动。但是在凋亡缺陷性细胞的死亡中,自噬又是细胞死亡必需的,这表明了自噬的双重性。自噬的调节是一个精密而复杂的基因调控过程,在各阶段都受到多种调节因子的作用。自噬可以分为mTOR依赖途径和mTOR非依赖途径,在前者中主要的分子机制是通过Akt/mTOR信号通路和其下游底物发挥作用,并参与调节翻译和细胞生长。而细胞自噬和周期也相互联系,并且mTOR在其中发挥重要作用。在我们实验室的前期工作中,发现在除血清和生长因子条件诱导的血管内皮细胞的凋亡过程中,小分子化合物3g通过诱导Ingerinβ4蛋白磷酸化并诱导入核,从而有效地诱导血管内皮细胞凋亡。但是其是否能够在肿瘤细胞中发挥抑制生长的作用从而成为一个有效的肿瘤治疗药物则还不清楚。而且其是否会对正常细胞的生长产生影响是寻找新型药物的重点之一,寻找到能够特异性抑制肿瘤细胞的化合物能够为药物开发提供新的前景。磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1),也被称为Raf激酶抑制蛋白,参与了MAPK,GPCR,NF-κB,GSK3β等多种细胞生长相关的信号通路的调控。PEBP1可以通过参与多种将细胞外刺激转化成不同信号以维持细胞完整性和体内平衡的通路。结肠癌患者的PEBP1启动子甲基化程度远远高于正常样本,这表明了其异常在结肠癌起始中潜在的重要性。而且最新的研究中PEBP1和LC3的直接相互作用得到了验证,PEBP1通过保守的LIR基序和LC3结合并且抑制营养剥夺的自噬,而且是通过PEBP1S153的磷酸化发挥作用的。本研究利用化学遗传学的原理与技术,以化合物小分子3g为研究工具,研究了其特异性抑制结肠癌细胞生长中的具体分子机制,确定了其在调控细胞自噬和细胞周期中发挥的作用,为结肠癌的治疗提供新的靶点和有效工具。研究方法1.人结肠癌Hct116细胞、人脐静脉血管内皮细胞、人肺腺癌A549细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人前列腺癌PC3细胞的培养2.倒置相差显微镜观察细胞形态学变化3.SRB法检测细胞存活率4.Heochest染色后,通过荧光显微镜观察细胞核形态的变化,从而判断细胞是否凋亡5.LDH(乳酸脱氢酶)检测细胞是否发生坏死6.流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期7.激光共聚焦显微镜检测LC3-II的分布8.western blot检测PARP和caspase-3蛋白切割水平,LC3-II和p62蛋白表达水平,以及Akt,mTOR,P70S6K,4EBP1,PEBP1的磷酸化水平9.鸡胚尿囊膜人移植瘤模型研究小分子化合物对实体瘤进展和正常血管生成的影响研究结果1.吡唑环氧烷衍生物具有对多种肿瘤细胞的生长抑制作用1.1 SRB检测结果表明,小分子化合物3g(1-10 μM)作用于多种肿瘤细胞后,均能显著抑制细胞的存活。其中,化合物对结肠癌细胞Hct116细胞的抑制作用最强。并且在同样浓度下不影响正常培养条件的血管内皮细胞生长。1.2倒置相差显微镜观察细胞形态发现,化合物3g(2.5-10 μM)处理Hct1 16细胞24h后,细胞逐渐变圆。而3g处理A549细胞24h后,细胞发生了明显的拉长。1.3 Heochest染色结合荧光显微镜观察化合物3g(2.5-10 μM)处理肿瘤细胞24 h后,核凝集现象与对照组相比变化不明显。1.4流式细胞术结果表明,化合物3g(5μM)处理Hct116细胞24h后,处理组与对照组相比凋亡率没有发现显著升高1.5 Western-blot 检测在 12h、24h、48h 时 3g(5 μM)可能不能诱导 PARP 和caspase-3切割上调。1.6 LDH检测发现,化合物3g(10 μM)处理多种肿瘤细胞48 h后,培养液上清中LDH活性没有显著性差异,表明细胞没有发生坏死。2.小分子化合物3g通过调节细胞自噬和细胞周期发挥抑制作用2.1通过流式细胞术发现3g(5μM)处理Hct116细胞24h后会引起G1期细胞阻滞。2.2 western blot结果表明,设计不同的时间点使用3g(5 μM)处理Hct1 16细胞后,与对照组相比,3h、6h时Hct116细胞中LC3-Ⅱ表达显著增强,而在48h时自噬流被明显阻断。2.3免疫细胞化学检测发现,3g(5 μM)处理Hct116细胞3h后,与对照组相比,Hct116细胞中LC3出现了点状聚集。2.4 western blot结果表明,使用3g(5μM)处理Hct116细胞后,与对照组相比,短时间内Hct1 16细胞中Akt和mTOR的磷酸化被抑制。2.5 western blot结果表明,使用3g(5 μM)处理Hct1 16细胞后,与对照组相比,短时间内Hct116细胞中mTOR的底物P70S6K和4EBP1的磷酸化被抑制。2.6 Western blot结果表明,使用3g(5 μM)处理H116细胞后,与对照组相比,短时间内Hct1 16细胞中PEBP1的磷酸化被抑制。2.7鸡胚尿囊膜人移植瘤模型在3g处理后,对比对照组,处理组的实体瘤发展被明显抑制,并且不影响其正常血管的发生。结论1.小分子化合物3g能够显著抑制多种人肿瘤细胞存活,且抑制作用呈现浓度的依赖性,其中对Hct116细胞的抑制作用最强,并且在同样浓度下不影响正常培养液培养的人脐静脉血管内皮细胞。2.小分子化合物3g不是通过诱导凋亡来抑制Hct1 16细胞的生长。小分子化合物3g能够在短时期内诱导自噬,而在长时间时阻断自噬流,并且发挥诱导细胞周期阻滞的作用。其具体分子机制是通过在短期内诱导PEBP1 S153位点的磷酸化,并抑制Akt/mTOR信号通路实现的。PEBP1的磷酸化可能能够参与调解mTOR依赖的细胞自噬。3.小分子化合物3g能够在鸡胚尿囊膜人移植瘤模型中抑制实体瘤的发展,说明其有发展成为肿瘤抑制药物的前景。